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1、,HPLC色谱柱选择与维护保养,Sa 安捷伦科技,安捷伦HPLC色谱柱选择,分离模式的选择,样品,溶于有机溶剂,溶于水,溶于四氢呋喃,非离子化,离子化,溶于有机溶剂,溶于水,溶于正己烷,溶于甲醇或甲醇/水 或乙腈或乙腈/水,用硅胶的正相模式,用键合相的正相模式,用键合相的反相模式,用键合相的反相模式,低分子凝胶渗透色谱,用键合相的反相模式,抑制电离反相键合相色谱,离子对键合相的反相模式,用硅胶的正相模式,离子交换模式,凝胶渗透色谱,凝胶过滤色谱,大孔填料的离子交换模式,用大孔填料的反相模式,分子量2, 000,分子量2, 000,反相分配色谱 极性:固定相 流动相 固定相 - 非极性 流动相(
2、甲, 乙醇, 乙腈, THF, 二氯乙烷)- 极性 非极性物质后出峰,正相吸附色谱 极性:固定相 流动相 固定相 - 极性 流动相(己烷, 庚烷)- 非极性 极性物质后出峰,正相色谱 20%,反相色谱 80%,正相 &反相色谱,硅胶基质- pH 38 Al2O3 . nH2O - pH114 聚合物基质 - pH114,高或低pH下, 硅胶会溶解,化学修饰困难,孔结构复杂, 孔径不均匀导致柱效不够高, 有机溶剂可能导致聚合物基质溶涨而受损,柱填料基质,C-18柱-性能影响因素,硅胶纯度 填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度 色谱柱尺寸 填料床的长度和内径 颗粒形状 球型或不规则型 粒径 平均颗粒直
3、径, 通常3-10m 表面积 颗粒外表面和内部孔表面的总和, 以m2/gram表示 孔径 颗粒的孔或腔的平均尺寸, 范围80-300,色谱柱物理性质,C-18柱-性能影响因素,键合类型 单体键合 - 键合相分子与基体单点相连 聚合体键合 - 键合相分子与基体多点相连 碳覆盖率 与基体物质相连的键合相的量 封端 键合步骤之后, 用短链将裸露的硅羟基键合后封闭起来,色谱柱化学性质,C-18柱-性能影响因素,A类硅胶 Original ZORBAX SIL (1970s) 由于带负电荷的残留硅羟基和酸性表面上金属含量高 (硅羟基的pKa低), 导致碱性化合物发生拖尾,B类硅胶 (高纯) ZORBAX
4、 Rx-Sil (1987) 由于金属含量低, 硅羟基pKa高, 碱性化合物不发生拖尾,Zorbax Rx-SIL: 11种金属 35 ppm (未检出其他杂质, 1ppm); 99.995% 纯度的二氧化硅,C-18柱-性能影响因素,ZORBAX生产工艺,微球表面的略微融合专利技术增强了硅胶填料的耐流动相冲刷能力-Zorbax色谱柱使用寿命长的技术保障,安捷伦拥有此项溶胶-凝胶填料专利技术,StableBond Eclipse XDB Bonus-RP Extend,ZORBAX Rx 多孔硅胶微球,色谱柱尺寸 - 对色谱分离的影响 短柱 (15-100mm) - 运行时间短, 柱压低 长柱
5、 (150-250mm) - 分辨率高, 运行时间长 窄径柱 ( 2.1mm) - 检测器灵敏度高 宽径柱 (3-21.2mm) - 载样量高,C-18柱-性能影响因素,颗粒形状 - 对色谱分离的影响 当使用黏度较大的流动相50:50=MeOH:H2O时, 球型颗粒可以降低柱压, 延长色谱柱寿命,C-18柱-性能影响因素,球形,不规则形,粒径 - 对色谱分离的影响 较小的颗粒柱效较高, 但会引起柱压过高. 3.5m粒径的常用于分离复杂的多组份样品, 而组份单一的样品多采用5m的粒径,1.8m 3.5m 5m 7m 10m,表面积 - 对色谱分离的影响 高表面积对于多组份样品的分离具有较强的保留
6、能力, 柱容量和分离度. 表面积低的填料通常能迅速达到平衡状态, 对于梯度淋洗尤为重要,C-18柱-性能影响因素,孔径 - 对色谱分离的影响 大孔的填料颗粒可以延长溶质大分子在填料表面滞留的时间, 达到充分分离, 改善峰形 样品 MW 4, 000, 选择 80 的孔径 样品 MW 4, 000, 选择 300 的孔径,大孔径填料适用于大分子分析,大孔径300 全多孔色谱柱 可用于分离蛋白质和多肽 分子量虽小但hydrodynamic volume(水动力学体积)较大的分子 Poroshell 色谱柱 高流速下, 高柱效分析大分子的蛋白质和多肽,色谱柱填料孔径必须适合待测物分子自由进出填料孔,
7、 与孔内表面的键合相进行分离分配,300 孔径可改善蛋白质和多肽峰形,选择合适的 填料孔径分析 大分子可获得 最佳峰形,300 孔径可改善大分子的峰形,色谱柱: 4.6 x 150 mm, 5 mm 流动相: 60% MeOH: 40% 0.1% 三氟乙酸 流速: 0.75 mL/min 温度: RT 检测器: UV 282 nm,溶液中的分子尺寸决定适宜的色谱柱孔径 窄的峰宽表明待测分子进入填料孔没有受到阻碍,分子量虽小但 hydrodynamic volume (水动力学体积)较大的分子,键合类型 - 对色谱分离的影响 单齿键合： 提高传质速率, 加快色谱柱平衡 双齿键合： 增加色谱柱稳定
8、性, 增加色谱柱的载样量,C-18柱-性能影响因素,碳覆盖率- 对色谱分离的影响 高碳覆盖率：提高分辨率, 分析时间长 低碳覆盖率：缩短运行时间,封端 - 对色谱分离的影响 封端：减轻待测组份与硅胶表面残留的酸性硅羟基反应而引起的色谱峰拖尾现象 对于极性样品, 未封端与经过封端处理的色谱柱在选择性上有明显差异,C-18柱-性能影响因素,固定相键合 二甲基硅烷,封端 四甲基硅烷,Si,O,OH,O,O,CH,3,Si,R,CH,3,CH,3,Si,CH,3,CH,3,Si,R,CH,3,R = C8,C18,etc,.,O,OH,OH,O,CH,3,Si,R,CH,3,CH,3,Si,R,CH,
9、3,+,+,Cl,CH,3,Si,CH,3,CH,3,OH,OH,OH,OH,CH,3,Cl,R,CH,3,(,TMS),传统键合及封端技术,取代基：五个 旁侧基团: 异丙基,Zorbax StableBond 空间位阻保护-抗水解能力,键合相 流失, 保留减弱,另一个裸露的硅羟基 , 潜在的拖尾因素,普通硅胶柱低 pH 2 不稳定, 发生水解,安捷伦专利的空间位阻保护,液相柱-保留值与pH的关系,pH变化值 0.1,RS变化值1.6,色谱柱：Zorbax StableBond C18 4.6 X 250mm, 5um 部件号：880975-906 流动相：27%甲醇：73%磷酸 pH 2.5
10、 & 2.6 温度：500C 流速： 1.0mL/min.,色谱柱: ZORBAX Eclipse XDB-C8 4.6 x 75 mm, 3.5 m 流动相: 44% 25 mM磷酸, pH 7.00 : 56% 甲醇 流速: 1.0 mL/min 温度: 25C 检测: UV 250 nm,可电离的组份的分离可能会随pH变化发生显著变化 甚至很小的 0.050.25 个pH变化单位.,样品: ketoprofen ethyl paraben Hydrocortisone fenoprofen propyl paraben Propranolol ibuprofen,液相柱-保留值与pH的关
11、系,0.25 个pH,液相柱-保留值与pH的关系,pH变化： 0.2个pH(7.07.2) 保留时间改变： 1.2分钟 (13.614.8分钟),保留时间随pH 改变不明显,保留时间随pH改变 不明显(酸性环境中),方法稳定区 方法波动区(pKa+1.5) 方法稳定区,液相柱-保留值与pH的关系,液相柱-保留值与pH的关系,复杂组分的流动相pH选择技巧,色谱柱: ZORBAX Extend-C18 4.6 x 150 mm, 5 mm 流动相: 30% 缓冲液: 70% MeOH pH 7 缓冲液20 mM Na2HPO4 pH 11缓冲液 20 mM TEA 流速: 1.0 mL/min 温
12、度: RT 检测器: UV 254 nm,0 5,1,2, 3,4,5,Time (min),7,6,Extend-C18 pH 7,1. Maleate 马来酸盐 2. Scopolamine 东莨菪碱 pKa 7.6 3. PseudoEphedrine 假麻黄碱 pKa 9.8 4. Doxylamine 抗敏安(多西拉敏) pKa 9.2 5. Chlorpheniramine 氯苯吡胺pKa 9.1 6. Triprol内径ine 苯丙烯啶pKa 6.5 7. Diphenhydramine 苯海拉明 pKa 9.0,Extend-C18 pH 11,0 5 10,1,2,3,4,T
13、ime (min),6,5,7,高pH下, 碱性成分的保留增加,待测物pKa+1.5以外 的流动相pH 可保证方法的稳定性,Zorbax色谱柱发展史,1973 ZORBAX SIL 发明专用于HPLC分离的球状、小颗粒硅胶(专利) 1977 ZORBAX ODS 单官能团, 单层键合相发明者之一 1978 ZORBAX column 首先推出色谱柱的质量信誉保证 1982 ZORBAX GF-250 改善了蛋白质尺寸分离的稳定性 1987 ZORBAX Rx-SIL 推出适合碱性化合物的HPLC分离的全新硅溶胶技术(专利) 1990 ZORBAX StableBond 增强了低pH条件下键合相
14、的稳定性(专利) 1996 ZORBAX Eclipse XDB 双封端技术提高了中等pH条件下键合相的稳定性(专利) 1997 Zorbax LC/MS column 15和30 mm(3.5um)快速, 高分辨率, 高通量LC/MS色谱柱 1998 ZORBAX Bonus-RP 极性键合技术使碱性化合物的分离得到改善(专利) 1999 ZORBAX CombiHT 专为小规模组合化学样品制备设计的高通量色谱柱 1999 ZORBAX Eclipse dsDNA 用于分析双链DNA的多孔硅胶柱 1999 ZORBAX Carbohydrate 分析单, 双, 三糖和糖醇的专用柱 1999
15、Zorbax Extend C18 独特宽pH跨度, 高pH下使用的硅胶基质色谱柱(专利) 2001 Zorbax SB-aq 可在低pH下(18)使用100%水相的填料(专利) 2002 Zorbax Poroshell 300SB 蛋白质高速, 高效反相分离新填料 2002 ZORBAX 3.0mm 内径. 3-mm 柱径溶剂节省柱 2003 ZORBAX sub 2 micron 1.8um粒径的高通量, 超高速色谱柱 (5月1日上市) 2003 ZORBAX PrepHT 高通量全系列制备柱-分析柱向制备柱直接放大 (6月1日上市),键合相-适用pH范围,低pH下, 分析酸性, 碱性和中性组分, 峰形优异, 柱寿命长,中等pH下, 分析酸性, 碱性和中性组分, 尤其碱性组分峰形优异, 柱寿命长,
