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1、中药分析概论 Analysis of traditional Chinese medicines,目 录,中药分析的特点,1,2,鉴别实验,3,检查,4,含量测定,5,中药安全性相关的质量控制项目,6,中药指纹图谱和特征图谱,7,中药分析的样品处理方法,中药体内分析,8,Traditional Chinese Medicine / herbal medicine 以中医药学理论体系的术语表述其性能、功效和使用规律，并且按中医药学理论指导其临床应用的传统药物。,中药,中国药典2010年版I部 药材和饮片 植物油脂和提取物 成方制剂和单味制剂,中药,中药分析的特点,以中医药理论为指导，评价中药质量
2、的整体性 化学成分的多样性和复杂性 药效成分的非单一性 原药材质量的差异性 工艺、炮制方法及辅料的特殊性 杂质来源的多途经性 质量控制方法的多源性,五倍子 鞣质（70%） 槐米 芦丁（20%） 长春花 长春新碱（百万分之一）,2、各种有效成分含量相差悬殊,1、成分复杂且多数有效成分尚不十分清楚,中药分析的特点,7,原因：生长环境、采收季节及部位差异,不同产地 金银花：绿原酸；山东平邑所产为5.66%，山西大谷为3.88%，云南大理为1.81%,采收季节 丹参：丹参酮 11、12月份含量最高,3、中药材质量的不稳定性,例：三黄泻心汤干浸膏,常压 减压 逆浸透 成分 浓缩 浓缩 喷雾,大黄酸葡萄糖
3、苷 41.1 51.6 98.6%,小檗碱 34.5 37.5 94.5%,黄连碱 6.3 12.0 93.7%,黄岑苷 77.4 77.6 98.5%,4、制剂工艺不同，有效成分含量也不同,针对不同的剂型，采用相应的方法进行分离纯化后测定,蜜丸 蜂蜜 锭剂 糯米粉、黄米粉 胶剂 豆油、黄酒、冰糖,5、剂型繁多，辅料干扰大,中药制剂易含有较高的重金属、砷盐和残留农药等杂质,非药用部位、泥沙 重金属、残留农药 包装、保管不当发生霉变、虫蛀 洗涤原料的水质二次污染,6、杂质来源复杂，需控制,液体制剂：合剂、口服液、酊剂等 半固体制剂：煎膏剂、流浸膏 固体制剂：丸剂、散剂、片剂、胶囊剂等,中国药典（
4、2010年版）一部（二十六种）,中药制剂的分类,中药分析的一般程序,13,中药制剂成分的多样性和复杂性，需进行样品前处理； 前处理的目的：对待测组分进行提取、分离、纯化，排除制剂中的其他组分和辅料等干扰,中药分析的样品前处理,14,取样供试品溶液的制备,超声提取法* 回流提取法 连续回流提取法 萃取法 水蒸气蒸馏法 超临界流体萃取法,利用超声波的助溶作用进行提取,超声波振荡器（超声波清洗器）,简便 省时 提取率高,样品置有机溶剂中加热，蒸发的溶剂经冷凝流回样品管的提取方法,用于皂苷类,正丁醇,氯仿,乙醚、石油醚,醋酸乙酯,萃取法利用溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解度的不同,用于生物碱类,用于黄酮
5、类,用于挥发油,超临界流体萃取（SFE法）,超临界流体是指在临界温度和临界压力以上的流体，介于气体与液体之间的一种物相。,超临界CO2：Pc=7.37MPa ；Tc=31.3,19,超临界流体萃取法,CO2萃取过程无味、无臭、无毒，安全性好； CO2价格便宜，纯度高，可循环使用； 样品易浓集；,药味的选取原则,单味制剂，直接进行鉴别和含测； 复方制剂，应按照君、臣、佐、使选择药味； 应首选君药、臣药、贵重药、毒性药。 凡有原粉入药者，应该作显微鉴别。 原则上处方中的每一药味均应进行鉴别，选择尽量多的药味（1/3药味）。,鉴别与含量测定,药味的选取原则,选择明确的有效成分或类别清楚的某一类总成分
6、进行含量测定 检测成分应归属某单一药味 检测成分应与中医用药的功能主治相近 无法含量测定的，可测定浸出物含量,鉴别： 性状鉴别 显微鉴别 色谱法鉴别,含量测定： 高效液相色谱法 薄层扫描法 气相色谱法,含生药粉制剂 丸剂、片剂、胶囊剂、散剂 快速，简便，覆盖面大,显微鉴别,色谱鉴别,TLC法应用最多 （Rf、颜色、荧光） GC法 含挥发性成分的药物 HPLC法常与含量测定同时进行,处方 牛黄10g 朱砂60g 黄连200g 黄芩120g 栀子120g 郁金80g 方药分析 牛黄清热解毒药，主含胆酸类成分 黄连清热燥湿药，主要为小檗碱 黄芩清热燥湿药，主要为黄酮类 栀子清热泻火药，主含栀子甙 朱
7、砂安神药，主含硫化汞（HgS） 郁金活血去瘀药，主含挥发油,示例 万氏牛黄清心丸,黄芩苷,供试品,黄芩空白,栀子苷,供试品,栀子空白,中药及其制剂分析的杂质检查,中药制剂特有的剂型及检查项目,丸剂-水分、溶散时限 散剂-粒度（外用）、外观均匀度 煎膏剂（膏滋）-相对密度、不溶物 流浸膏剂与浸膏剂-乙醇量 茶剂-水分、溶化性 胶剂-总灰分、重金属、砷盐 酒剂-乙醇量、总固体、甲醇量 露剂-pH值,烘干法（不含或少含挥发性成分） 甲苯法 （含挥发性成分） 减压干燥法（含挥发性成分贵重药） GC法,水分的测定,酸不溶性灰分的测定,总灰分的测定,含量测定,限度规定 中药及其制剂中待测成分的含量限度，一
8、般规定下限，如马鞭草按干燥品计算，含熊果酸不得少于0.36%。 毒性中药应规定上下限。例如马钱子按干燥品计算，含士的宁应为1.202.20%。 多植物来源的药材，如药材能区分开的，其含量差异较大的，可制订两个指标。,含量测定,常用定量方法 化学分析法 挥发油测定法 分光分度法 HPLC GC 薄层色谱扫描法,含量测定,相对校正因子法同时测定中药多指标成分的含量 原理：又称为一测多评法，是基于中药中常含有具有相似母核结构的同一类成分，通过实验计算出各成分吸收系数间稳定的相关数值，仅测定1个有对照品的目标成分，进而计算出其他同类成分的含量。 所选择的质控指标应是药材中的有效成分或指标性成分，待测成
9、分应有相对较高的含量；样品收集应选择有代表性的药材，样本数具有统计学意义；并进行各项分析方法学指标验证。 中国药典采用此法对黄连中的表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱进行含量测定,中药安全性相关的质量控制项目,重金属与砷盐检查 农药残留量分析 黄曲霉素测定：桃仁、杏仁及相应制剂 中药注射剂：重金属和有害元素限度 中药掺伪掺假和非法添加的检查 毒性成分的控制：附子：含双酯型生物碱，毒性强，采用TLC对乌头碱限量检查；,重金属与砷盐检查,ChP附录收载有四种重金属检查法 砷盐检查法：古蔡法和二乙基二硫代氨基甲酸银法 双硫腙比色法：选择性地测定制剂中的铅 原子吸收分光光度法：铅使用铅空心阴极灯（283
10、.3nm）测定；砷用砷空心阴极灯（193.7nm） 高效液相色谱电感耦合等离子体质谱（HPLC-ICP-MS）：测定中药中不同价态重金属离子的含量,残留农药种类,有机氯类：六六六、DDT、五氯硝基苯、艾氏剂 有机磷类：磷酸酯类（敌敌畏、敌百虫）、硫代磷酸酯类（对硫磷）、磷酰胺及硫代磷酰胺（甲胺磷） 拟除虫菊酯类：氯氰菊酯、溴氰菊酯 氨基甲酸酯类：西维因、呋喃丹,农药残留量分析,ChP2010一部附录IX Q 农药残留量测定法,有机氯类农药残留量测定 色谱条件与系统适用性试验： SE-54（30m 0.32mm 0.25um）或DB-1701，63Ni- ECD电子捕获检测器。进样口温度：230
11、；检测器温度：300；不分流进样；程序升温：初始100，每分钟10升至220，每分钟8升至250，保持10分钟。 理论塔板数按-BHC峰计算，不低于106，分离度应大于1.5。,混合对照品溶液：BHC（、-BHC），DDT（PP-DDE、PP-DDD、OP-DDT、PP-DDT），五氯硝基苯（PCNB），溶剂为石油醚（60-90）； 供试品溶液制备：药材、中药制剂 进样量：1ul 按外标法计算9种农药残留量,中药掺伪造假,掺杂掺伪造假 用白芍的根茎部分染色加工成川乌、草乌 用红薯染色加工成制首乌； 用淀粉压模制成冬虫夏草； 西洋参掺入生晒参短枝 用薄纸切细丝染色掺杂于西红花中； 滥用硫磺熏蒸药
12、材使美观和防虫蛀,莪术伪充三七的鉴别,三七具有散瘀止血、消肿定痛等功能，因其疗效显著，商品价格昂贵，一些不法商贩在利益驱动下，以廉价的莪术伪充。 莪术作用峻猛，伪充三七可能产生副作用，故应加以区别应用 粉末显微鉴别 薄层色谱鉴别,粉末显微鉴别 三七 （1）木栓细胞呈长方形或多角形，壁薄，棕色； （2）淀粉粒众多，单粒呈类圆形、多角形或不规则形，直径330 m； （3）树脂道内含棕黄色滴状或块状分泌物； （4）导管以网纹多见，直径1640 m； （5）草酸钙簇晶稀少，棱角较钝,莪术 （1）非腺毛多已呈碎片，完整者极少； （2）淀粉粒大多糊化成团块，未糊化淀粉粒多为单粒，卵圆形，短杆状，长2341
13、 m，宽1924 m，有明显层纹； （3、4）导管多为螺纹、梯纹，少数导管伴有杆状纤维群，纤维壁孔明显，导管及纤维均木化。,中药指纹图谱,定义：运用现代分析技术表征和评价具有代表性中药化学成分群信息。 “现代分析技术”：光谱、色谱、波谱、联用技术，以及化学计量学和计算机技术等。 “中药化学成分群”：药材、饮片、中药提取物和成药中与药理活性相关的，由次生代谢产物组成的化合物群。 “代表性”：中药化学成分群信息须具有统计学意义的样本数。,国外应用情况,美国FDA允许草药类食品添加剂申报中可以提供色谱指纹图谱。 WHO在草药评价指导原则中规定若活性成分不明，可以提供色谱指纹图谱以证明产品质量的一致性
14、。 欧共体在草药质量评价的指南中指出，单靠测定某有效成分的稳定性是不够的。 国际上基本认可，草药色谱指纹图谱可以提供复杂成分的定性甚至定量信息，考察生产中的影响，控制产品的一致性。,色谱指纹图谱的基本属性,模糊性 强调分析、比较指纹图谱的相似性，而不是完全相同。,是一种综合的、量化的色谱鉴别手段。,整体性 将指纹图谱作为一个整体来分析和比较它的综合特征以达到鉴别的目的。,系统性：指图谱所反映的化学成分全部信息，其中包括中药有效部位所含主要成分的种类，或指标成分的全部。 特征性：指图谱中反映的化学成分信息是具有高度选择性的，这些信息的综合结果，将有助于特征区分中药的真伪与优劣。 稳定性：在规定的
15、方法与条件下，不同的操作者和不同的实验室应能作出相同的指纹图谱。,指纹图谱的制定原则,中药 预处理,中药液相色谱 分析条件,分离,指纹图谱,调整色谱条件,N,1.计算机辅助指纹图谱评价 2.多成分定量分析方法建立,色谱指纹图谱平台流程,中药指纹图谱工作站软件,中药体内分析,中药体内定量分析方法 中药药代动力学 代谢组学研究,示例：基于RPLC-HILIC-TOFMS技术的四逆汤治疗心肌梗死作用的血清代谢组学研究,采用亲水色谱和反相色谱相结合的策略进行研究，更加全面的发现心肌梗死的血清标志物，分析四逆汤对机体的调节作用,Fig. Typical serum total ion chromatog
16、rams separated on (a) RPLC and (b) HILIC. (c) Responses of standard L-isoleucine ion m/z 132.10 on RPLCMS and HILICMS.,RPLC-Q-TOFMS,HILIC-Q-TOFMS,对极性代谢物具有更好的保留 质谱响应增强，灵敏度提高,这是得到的反相和亲水的总离子流图，以异亮氨酸为例，我们发现相同的浓度下，在亲水模式下，具有更好的质谱响应，同时，我们能够观察到，在反相体系下，其流出接近于死时间，而在亲水色谱条件下，具有更好的保留行为。,Fig. PLS-DA scores plot from
