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1、动物实验基本技术和方法,广东药学院实验动物中心,主要内容,一、 实验前准备 二、实验动物抓取与固定 三、年龄的大致判断 四、性别、发情、与妊娠鉴定 五、编号和标记 六、分组 七、去毛 八、给药途径与方法 九、采血方法 十、其他体液采集 十一、麻醉方法 十二、处死方法 十三、动物病理检查,一、 实验前准备,理论准备：了解动物实验基础知识 制定研究计划和方案 查阅关于实验方法的参考文献 条件准备：仪器、器械、药品 运输 动物实验和饲养场所,二、实验动物抓取和固定,（一）小鼠,小鼠固定器固定,（二）大鼠,大鼠固定盒固定,（三）豚鼠,（四）家兔,兔子固定器固定,狗钳,狗的抓取固定,（五）犬,犬嘴固定方
2、法,猫的抓取,犬固定,（六）猴抓取与保定,猴徒手固定,三、年龄的大致判断,（一）大、小鼠 1、根据形态鉴定日龄（大、小鼠情况基本一样）,2. 根据体重鉴定日龄 小鼠日龄与体重的对应, 大鼠日龄与体重的对应,（二）豚鼠 一般老年豚鼠牙齿和趾爪长，被毛稀疏无光泽，眼神呆滞，行动迟缓。而年轻豚鼠牙齿短白，爪短软，眼睛圆亮，行动敏捷，被毛有光泽，且紧贴身体。同样，也可根据体重来推断大致年龄。同日龄豚鼠，雌性体重略高于雄性。与大鼠一样，其体重受多种因素的制约。实验对年龄要求比较严格时，必须由卡片记录提供准确年龄。,（三）家兔 家兔的门齿和爪随年龄增长而增长，是年龄鉴别的重要标志。青年兔门齿洁白，短小，排
3、列整齐；老年兔门齿暗黄，厚而长，排列不整齐，有时破损。白色家兔趾小基本呈红色，尖端呈白色。1岁家兔红色与白色长度相等；1岁以下，红多于白；1岁以上，白多于红。还可根据趾爪的长度与弯曲度来区别。青年兔趾爪较短，直平，隐在脚毛中，随年龄的增长，趾爪露出于脚毛之外，而且爪尖钩曲。另外，家兔皮薄而紧，眼神明亮，行动活泼的为青年兔；皮厚而松，眼神颓废，行动迟缓的为老年兔。,（四）犬 犬的年龄主要以牙齿的生长情况、磨损程度、外形颜色等情况综合判定。仔犬在出生后十几天即开始生出乳齿，2个月以后开始由门齿犬齿臼齿顺序逐渐更换为恒齿，8l0个月齿换齐。但犬齿需要1岁半以后才能长坚实。饲养场饲养的品种犬，可以根据
4、记录，明确了解年龄，而收购的杂种犬就无法知道确切年龄。实际中，可根据犬齿更换和磨损情况，估计犬的年龄。,四、性别、发情、与妊娠鉴定,（一）大、小鼠的性别鉴定,初生兔仔如阴部孔洞扁圆而略大于肛门，且与肛门相向、距离较近的是母兔；孔洞呈圆形而略小于肛门，孔洞向前而距肛门较远的是公兔。 三月龄以上的兔子，只要看有无阴囊即可区别公母。,（二）兔的性别鉴定,Female,Male,（三）大、小鼠发情鉴定,小鼠性周期阴道分泌物涂片变化,（四）妊娠鉴定,1、阴道栓法（大、小鼠、豚鼠） 2、外部检查法 3、摸胎法 4、阴道检查法 5、直肠检查法 6、超声波检查法 7、孕酮含量测定法,阴道栓,五、编号和标记,1
5、、染色法：浅色动物 3.5-5苦味酸溶液（黄色） 0.5%中性红或碱性品红溶液（红色） 煤焦油酒精溶液（黑色） 龙胆紫溶液（紫色）,2、打耳孔法：小型动物,3、剪趾法：小型动物,4、剪尾法：大、小鼠，仅限与两组间区分 5、烙印法：刺号钳，中、大型动物 6、针刺法：中、大型动物 7、号牌法：耳标签、项圈、腿圈，中、大型动物 8、剪毛法：大动物 9、笼子标号,六、分组,随机化分组：避免人为影响 例：将14只小鼠随机分成两组。 先将小鼠编为I14号， 在随机数字表上任点一数，按任意方向连续抄14个随机数字。 编排如下：,动物编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 随机
6、数字 16 22 77 94 39 49 54 43 54 82 17 37 93 23 归 组 B B A B A A B A B B A A A A 奇数代表A织，偶数代表B组 A组： 3 5 6 8 11 12 13 14 B组： 1 2 4 7 9 10 调整分组：接刚才随机数字23继续抄表得随机数字78，用78除以8（因为需要把A组的8个数字调整掉一个），得余数6，所以把A组的第6个动物，即12号动物调整到B组, 最终分组 A组： 3 5 6 8 11 13 14 B组： 1 2 4 7 9 10 12,例：12只大鼠随机分为3组 大鼠编号112 在随机数字表上任点一数，按任意方向连
7、续抄12个随机数字。 每个数分别用3除，记录余数， 根据余数分组 大鼠编号：1， 2， 3， 4， 5， 6， 7， 8， 9， 10， 11， 12 随机数字：08，27，01，50，15，29，39，39，43，79， 69，10 余数： 2， 0， 1， 2， 0， 2， 0， 0， 1， 1， 0， 1 组别： B， C， A， B， C， B， C， C， A， A，C， A, A：3，9，10，12 B；1，4，6 C：2，5，7，8，11 调整分组：接刚才随机数字10继续抄表得随机数字61，用61除以5（因为需要把C组的5个数字调整掉一个），得余数1，所以把C组的第1个动物，即2
8、号动物调整到B组。 最终分组 A：3，9，10，12 B；1， 2 ，4，6 C：5，7，8，11,七、去毛,1、剪毛：弯头剪毛剪。 2、拔毛：大小鼠尾静脉、家兔耳缘静脉注射。 3、剃毛：将剃毛部位先用剪刀粗剪一遍，蘸温肥皂水润湿，用剃刀顺着被毛方向剃毛，用电动剃毛推剪，则逆被毛向剃毛。,4、化学脱毛： 常用脱毛剂 8%硫化钠水溶液 硫化钠3份，洗衣粉1份、淀粉7份，加水调成糊状 硫化钡50克，氧化锌25克，淀粉25克，加水100毫升调成糊状 硫化钠10克，生石灰15克，加水到100毫升，适合犬和其他大动物。,八、给药途径与方法,（一）自动口服：加入饲料或饮水 （二）投喂药片：掰开口，放到舌根
9、部,（三）灌胃（i.g),1、小鼠、大鼠、豚鼠 灌胃时将灌胃针按在注射器上，吸入药液。左手抓住鼠背部及颈部皮肤将动物固定，右手持注射器，将灌胃针插入动物口中，沿咽后壁徐徐插入食道。动物应固定成垂直体位，针插入时应无阻力。若感到阻力或动物挣扎时，应立即停止进针或将针拔出，以兔损伤或穿破食道以及误入气管。 一般当灌胃针插入小鼠34cm，大鼠或豚鼠46cm后可将药物注入。常用的灌胃量小鼠为0.2 1ml，大鼠14ml，豚鼠为15ml。,2、狗、兔、猫、猴 灌胃时，先将动物固定，再将特制的扩口器放入动物口中，扩口器之宽度可视动物口腔大小而定，如狗的扩口器可用木料制成长方形，长约1015cm，粗细应适合
10、狗嘴，约23cm，中间粘一小孔，孔的直途为510cm。灌胃时将扩口器放于上述动物上下门牙之后，并用绳将它固定于嘴部，将带有弹性的橡皮导管（如导尿管），经扩口器上的小圆孔插入，沿咽后壁而进入食道，此时应检查导管是否正确插入食道，可将导管外口置于一盛水的烧杯中，如不发生气泡，即认为此导管是在食道中，未误入气管，即可将药液灌入。灌胃管插入长度狗为20cm，兔子为12-15cm。,动物最大灌胃量,（四）直肠给药 （五）呼吸道给药 （六）滴鼻 （七）点眼 （八）经皮肤给药：常用于检测药物、毒物、化妆品等的透皮吸收、局部作用、至敏作用等。家兔和豚鼠选择脊柱两侧皮肤，大小鼠常采取浸尾方式。 （九）皮内注射(
11、i.d)：一般用于接种或过敏实验。将药液注射在真皮和表皮之间。皮内注射时需将注射的局部脱去被毛，消毒后，用左手拇指和食指按住皮肤并使之绷紧，在两指之间，用注射器连4(1/2)号细针头，紧贴皮肤表层刺入皮内，然后再向上挑起并再稍刺入，即可注射药液，此时可见皮肤表面鼓起一白色小皮丘。,（十）皮下注射(s.c)：注射时以左手拇指和食指提起皮肤，将连有5（1/2）号针头的注射器刺入皮下。皮下注射部位一般狗、猫多在大腿外侧，豚鼠在后大腿的内侧或小腹部；大白鼠可在侧下腹部。兔在背部或耳根部注射。蛙可在脊背部淋巴腔注射。 （十一）肌肉注射(i.m)：股部肌肉,（十二）腹腔注射(i.p)：用大、小白鼠做实验时
12、，以左手抓住动物，使腹部向上，右手将注射针头于左（或右）下腹部刺入皮下，使针头向前推 0.51.0cm，再以45度角穿过腹肌，固定针头，缓缓注入药液，为避免伤及内脏，可使动物处于头低位，使内脏移向上腹。若实验动物为家兔，进针部位为下腹部的腹白线离开1cm处。,（十三）静脉注射(i.v)：,1、小鼠：尾静脉 2、大鼠：尾静脉、 阴茎静脉、 舌下静脉、 浅背侧跖静脉,大小鼠有上、左、右 3根尾静脉，成品字型,小鼠尾静脉注射,大鼠阴茎静脉注射,大鼠舌下静脉注射,大鼠浅背侧跖静脉注射,3、豚鼠：浅背侧跖静脉、耳静脉注射 4、家兔：耳静脉注射 5、猪：耳缘静脉 6、猴：前肢桡静脉、后肢隐静脉注射,猪耳缘
13、静脉注射,7、猫、狗：前肢内侧头静脉、后肢外侧小隐静脉注射,狗前肢内侧头静脉,狗后肢外侧小隐静脉,猴的后肢皮下静脉注射,（十四）脑腔注射： 1、小鼠 小指夹鼠尾，拇指和是指置小鼠头两侧固定，中指和无名指压住鼠身，在注射处消毒后，右手持注射器，以食指固定针芯，垂直刺入针头深度约57mm。 2、兔 将兔用固定器固定好，剃去头顶的被毛，左手将头皮绷紧，消毒后，右手持锥子，自头顶正中稍偏一侧部位，锥穿头骨，即换以左手固定锥子，右手持注射器，使针头沿锥尖刺入，慢慢拔出锥子，即刻将针头刺入约1020mm，即可推液。,（十五）关节腔注射： （十六）椎管内注射：注射入蛛网膜下腔 （十七）淋巴囊内注射：蛙和蟾蜍
14、,（十八）小脑延髓池注射：,几种动物不同给药途径的常用注射量（毫升）,九、采血方法,（一）大、小鼠： 1、眶静脉丛（窦）： 少量多次采大小鼠血。 小鼠0.20.3ml， 大鼠0.40.6ml 2、摘眼球：用于一次大量采小鼠血，可得到45体重的血量 3、尾静脉：用于少量多次采大小鼠血,尾静脉采血,4、剪头：用于一次性大量采小鼠血，可得到0.51.0ml的血量 5、大血管：包括颈动脉（静脉），股动脉（静脉），腋下动脉（静脉），腹主动脉，此方法不常用于小鼠采血，而多用于大鼠一次性大量采血。可得5ml左右血量。 6、心脏采血：小鼠少用，可用于大鼠一次性（开胸）或多次采血（不开胸）。,心脏采血,（二）家
15、兔 ： 1、耳缘静脉：中等血量的采集，可反复采血，每次510ml。 2、耳中央动脉：可反复采血，每次1015ml。,3、心脏采血：可用于 一次性（开胸）或 多次采血（不开胸）。 一次性开胸采血可 得到80100ml血量 4、颈动静脉采血：用于一次性采血，需要手术，可得血量8010ml。,（三）豚鼠： 1、心脏采血：可用于一次性（开胸）或多次采血（不开胸）。一次性开胸采血可得到510ml血量。 2、背跖静脉采血：用于少量反复采血。 3、耳缘剪口采血,（四）犬猫：和静脉注射部位相同，前肢内侧头静脉、后肢外侧小隐静脉。也可颈静脉（动脉）或心脏采血。,（五）猪：前腔静脉或耳大静脉采血 （六）羊：颈静脉
16、采血 （七）猴：前肢头静脉、后肢皮下静脉或耳缘静脉等。 （八）禽类：翼下静脉,仔猪前腔静脉采血,采血注意事项,（一）采血场所有充足的光线；室温夏季最好保持在2528，冬季，1520为宜； （二）采血用具有采用部位一般需要进行消毒； （三）采血用的注射器和试管必须保持清洁干燥； （四）若需抗凝全血，在注射器或试管内需预先加入抗凝剂。 （五）注意不同动物的采血量采血。,、取少量血,、取中量血,、取大量血,4、最大安全采血量与最小致死采血量,常用抗凝剂： 1、肝素：抑制凝血酶活力，阻止血小板凝集。纯品肝素1mg125U，10U20U抗1ml血凝集，但通常应用23倍剂量。 用法：可配成1%肝素溶液，用时取0.1ml于试管内，100烘干，每管可抗凝510ml血。或用1%肝素溶液湿润采血注射器。 肝素可改变蛋白质等电点，当用盐析法分离蛋白作分类测定
