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1、分子生物学实验,教师：李洪丽 电话：13604591160,实 验 三,核酸的琼脂糖凝胶回收技术,实验目的,实验原理,实验仪器、材料、试剂,实验步骤,1,2,3,4,注意事项,思考题,5,6,实 验 目 的,学习DNA纯化的原理和方法； 掌握利用试剂盒从凝胶中回收 DNA的方法。,实 验 原 理,DNA的纯化：去除影响DNA连接酶活性的物质以及其它的DNA片段， 回收得到纯的目的DNA片段。,DNA片段的凝胶回收根据回收片段大小不同可采用不同方法： 常规片断级（DNA片段为100bp-10kb）：主流方法是柱回收试剂盒 大片段级（DNA片段7kb）：可选方法是玻璃奶/纯化填料胶回收试剂盒，电洗
2、脱法 小片段级（DNA片段100bp）：柱回收试剂盒,实 验 原 理,试剂盒可以直接从PCR产物中或琼脂糖凝胶中回收DNA片段，有效地加快了DNA的纯化速度。,实 验 原 理,试剂盒主要含有： 柱式离心管 Binding Buffer Wash solution Elution Buffer,实 验 原 理,柱式离心管：含有一小片滤膜，通常是DEAE纤维素膜，是一种吸附阴离子基团的阴离子交换纤维素，它能够结合带有负电荷的DNA分子。,实 验 原 理,Binding Buffer：溶解琼脂糖凝胶块， 释放DNA。 Wash solution：冲洗杂质。 Elution Buffer：洗脱并保存D
3、NA。,实 验 原 理,回收的DNA适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、文库筛选、连接和转化等实验。,实 验 原 理,实验仪器、材料、试剂,1、仪器：恒温水浴锅、移液器、离心机； 2、材料：DNA； 3、试剂：普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂 盒（离心柱型）。,1、柱平衡：向吸附柱中加入500l平衡液， 将其放入收集管中，12000rpm离心1min， 倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放 回收集管中。 2、取一离心管，称取重量，记为M0。 3、将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中 切下，放入称取过重量的离心管中，再 称取重量，记为M1，计算M1-M0=M。,实 验 步 骤,4、若M=0.1
4、g，则其体积视为100l，向胶块 中加入（3000*M）l的溶胶液，50水浴 放置10min，期间不断温和上下翻转离心 管，直至凝胶完全溶解。 5、将上一步所得溶液加入一个吸附柱中，并 放入收集管中，室温放置2min，12000rpm 离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附 柱放回收集管中。,实 验 步 骤,6、向吸附柱中加入600l漂洗液12000rpm 离心1min，倒掉废液。 7、再向吸附柱中加入600l漂洗12000rpm 离心1min，倒掉废液。 8、吸附柱放回收集管，12000rpm离心2min ，室温放置3min。,实 验 步 骤,9、将吸附柱放到一个干净的离心管中，向 吸附膜
5、中间位置悬空加入30l洗脱缓冲 液，室温放置2min，12000rpm离心2min。 10、将离心管中收集到的液体再重新滴加到吸 附柱中，室温放置2min，12000rpm离心 2min。,实 验 步 骤,将回收得到的DNA片段用核酸蛋白检测仪检测其浓度和纯度。 1OD260=50ug/ml双链DNA OD260/OD280=1.71.9表示纯度较好,实 验 步 骤,注 意 事 项,1、切胶时要戴手套，防止溴化乙锭的污 染，并且应快速操作，在紫外灯下时 间长容易伤害到眼睛。 2、称胶时要计算准确。 3、加入漂洗液、洗脱缓冲液时，要对着 滤膜滴加，并且不要刺破滤膜。,思 考 题,1、DNA片段回收后可用于哪些实验操作？,
