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1、-浅谈细菌内毒素,1,2,主要内容,当消过毒的溶液或物体如针状的注射器插入无发热症状的病人体内一会可能就引起病人冷感、寒战、发热、头痛、恶心、呕吐、肤色灰白、休克、严重时导致死亡。这样的事例屡见不鲜，即使这些溶液和器具都经过消毒,3,细菌内毒素的简介,20世纪40年代青毒素刚问世的时候，医生发现青霉素对脑膜炎奈瑟菌引起的流行性脑膜炎疗效非常显著。因此，凡发现这类病人，一律优选青霉素进行治疗；且按照一般规律，用药剂量随病情严重程度而递增。结果发生了意外，用大剂量青霉素治疗重症脑膜炎患者时，不少患者却发生了休克而死亡,4,细菌内毒素的简介,细菌内毒素的发现,细菌内毒素这个概念在1890年的时候就已
2、被提了出来，它是在研究发热物质过程所引成的，1933年Boivin最先由小鼠伤寒杆菌提取出来，进行化学免疫学方面的研究，到1940年时候，Morgan使用志贺氏痢疾菌阐明了细菌内毒素是由多糖脂质及蛋白质三部分所组成的复合体，到了1950年以后，随着生物学，物理化学，免疫学以及遗传学等的进步发展，细菌内毒素的研究工作，尤其是其化学结构组成及各种生物活性间的关系也更加明确起来。,Boivin：,Morgan：,什么是热原？广义上说，微量即能引起恒温动物体温异常上升的物质，统称为热原。广义的热原也包括外因性热原(细菌性热原、化学热原)和内因性热原。而狭义的热原即内毒素。在临床上，当受热原污染的注射剂
3、从静脉注入人体时，患者常在0.5h1h内发冷，继而出现寒颤、发热、出汗、呕吐等不适症状，有时体温升高可至40以上，严重者甚至休克死亡，这种现象称之为“热原反应”,6,热原,7,细菌内毒素的简介,内毒素Endotoxin,外毒素Exotoxin,细菌毒素,外毒素（Exotoxin）：它是一种毒性蛋白质，是细菌在生长过程中分泌到菌体外的毒性物质。产生外毒素的细菌主要是革兰氏阳性菌。如白喉杆菌、破伤风杆菌、肉毒杆菌、金黄色葡萄球菌以及少数革兰氏阴性菌。 内毒素（Endotoxin）：是革兰氏阴性菌的细胞壁外壁层上的特有结构。细菌在生活状态时不释放出来，只有当细菌死亡自溶或粘附在其它细胞时，才表现其毒
4、性，内毒素的主要化学成分是脂多糖中的类脂A成分。,外毒素与内毒素的对比,9,内毒素是由多糖、脂质和蛋白质组成的复合体。脂多糖又由化学和生物性质不同的特异O 抗原、核心多糖和类脂A（脂质A） 组成。,内毒素的多糖结构,11,内毒素 endotoxin,G-菌中内毒素位置,性质稳定：具有耐热性，一般需要煮沸或更高温度才能被破坏。 作用无特异性：内毒素致病症状和病理变化大致相同，如发热、白细胞增高、腹泻、血管舒缩机能紊乱，糖代谢紊乱，严重时甚至发生休克。 致热性： 内毒素作用于人体细胞，使之释放内原性热原，再刺激下丘脑体温调节中枢，引起发热反应 分子极性：多糖链有亲水性，脂肪链具有疏水性在水中呈不均
5、匀分布 酸碱性：与强酸强碱水解反应 鲎反应性,12,内毒素的一般特性,危害： 内毒素能够直接作用于人体，激活组织内的炎性细胞和炎症因子，导致机体发热并产生全身性炎症反应，继而引起弥散性血管内凝血、休克、多脏器功能衰竭等严重的病理生理症状，危及生命。,13,细菌内毒素的简介,内毒素在人体引起的症状,14,发热反应 白细胞反应 内毒素血症与内毒性休克 弥漫性血管内凝血,发热反应 人体对细菌内毒素极为敏感。极微量（1-5纳克/公斤体重）内毒素就能引起体温上升，发热反应持续约4小时后逐渐消退。自然感染时，因革兰氏阴性菌不断生长繁殖，同时伴有陆续死亡、释出内毒素，故发热反应将持续至体内病原菌完全消灭为止
6、。内毒素引起发热反应的原因是内毒素作用于体内的巨噬细胞等，使之产生白细胞介素1、6和肿瘤坏死因子等细胞因子，这些细胞因子作用于宿主下丘脑的体温调节中枢，促使体温升高发热。,15,细菌内毒素在人体引起的症状,白细胞反应 由于绝大多数被革兰氏阴性菌感染的患者血流中白细胞总数都会增加，所以现在医生在诊断前，为了初步区别是细菌性感染还是病毒性感染，常常要化验病人的血液，对白细胞进行总数测定和分类计数。被病毒感染的病人，其白细胞总数和中性粒细胞百分比基本在正常值范围内。,16,糖代谢紊乱 先发生高血糖，转而为低血糖，大量糖元消耗，可能与肾上腺素大量分泌有关。 血管舒缩机能紊乱 内毒素激活了血管活性物质（
7、5-羟色胺、激肽释放酶与激肽）的释放。末梢血管扩张，通透性增高，静脉回流减少，心脏输出量减低，导致低血压并可发生休克。因重要器官（肾、心、肝、肺与脑）供血不足而缺氧，有机酸积聚而导致代谢性酸中毒。 此外，内毒素还能引起早期粒细胞减少血症，以后继发粒细胞增多血症等。,17,二.内毒素的检测方法,原理,器具的处理,供试品内毒素的检测,内毒素的检测方法,细菌内毒素检查包括： 限量实验 凝胶法 半定量实验 可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。,19,浊度法 动态浊度法 光度测定法 终点浊度法 显色基质法 动态显色法 终点显色法,内毒素检查方法,1956年
8、美国人Bang发现美洲鲎血液遇革兰氏阴性菌时会产生凝胶。其后Levin和Bang又搞清楚微量革兰氏阴性菌内毒素也可以引起凝胶反应，从而创立了鲎试剂检测法。由于鲎试剂法简单快速灵敏准确，目前已广泛用于临床、制药工业药品检验等方面。,20,鳌试剂的发现,内毒素凝胶法检测原理,21,原理： 利用鲎试剂与微量内毒素产生凝集反应的现象，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 阳性结果,细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示。,坚实凝胶 阳性“+”,22,内毒素凝胶法检测原理,未形成凝胶 凝胶不坚实 阴性“”,23,内毒素凝胶法检测原理,耐热器皿常用干热灭菌法（250、60 分钟以上）去除
9、，塑料用具应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械（目前多为无热原的一次性用品 ）或用强碱煮30分钟以上。,24,器具的处理,阳性对照溶液的制备 用检查用水将内毒素标准品稀释制成2浓度的内毒素标准溶液。 供试品阳性对照溶液的制备 用待检测的供试品溶液或其稀释液将内毒素标准品制成2浓度的内毒素溶液。 阴性对照 即细菌内毒素检查用水。 鲎试剂的准备 取规格为0.1ml/支的鲎试剂8支，每支加入0.1ml检查用水使溶解备用。 加样 8支管中2支加入0.ml供试品溶液或其稀释液作为供试品管，2支加入0.1ml阳性对照溶液作为阳性对照管，2支加入0.1ml检查用水作为阴性对照管,2支加入0.1ml供试品
10、阳性对照溶液作为供试品阳性对照管。 将试管中溶液轻轻混匀后，用封口膜封闭管口，垂直放入371水浴或适宜恒温器中，保温602分钟。,25,供试品细菌内毒素检查,结果判断 当阳性对照都为阳性、供试品阳性对照都为阳性且阴性对照都为阴性时，实验方有效。,26,供试品细菌内毒素检查,供试品细菌内毒素检查,例 某葡萄糖注射液，其内毒素限值为0.5EU/ml，设所用鲎试剂的灵敏度为0.125EU/ml。 MVD=CL/=0.5/0.125=4 将样品进行4倍稀释，并做4倍稀释下的供试品阳性对照。,27,28,细菌内毒素的去除,离子交换色谱法,活性炭吸附法,亲和色谱法,250干烤1h以上,相分离法,微孔滤膜法
11、,化学降解法,由于内毒素具有较大的相对分子质量，因此可选用超滤膜去除水中的内毒素。超滤膜的孔径及材质的选择，需视被处理药物的相对分子质量、特性、及药品中热原的含量而定。 缺点： 1、此时操作过程中的压力较高，另外对部分含有较大相对分子质量成份的医药制剂也不合适。 2、因为在除去热原的同时会阻留或吸附药液中的有效成份，使产品收率大受影响。,29,超滤膜和荷电微孔滤膜法,由于内毒素分子在中性条件下本身带负电荷，因而选择带有正电荷的材质如聚砜、聚丙烯腈、聚酰胺等微孔滤膜可增强对内毒素分子的去除效果，另外，也有人将硅藻土涂渍在纤维素膜上，然后在其上吸附上荷正电聚电解质，用于去除内毒素。 缺点：这些荷电
12、微孔滤膜对内毒素的去除效果受pH的影响较大,30,活性炭用于去除内毒素是由于内毒素的相对分子质量较大，这种方法适合于组分较为简单的小分子的溶液中或水中内毒素的去除。比较适合纯水溶液中内毒素的去除。 缺点：由于活性炭的选择性较差，易吸附有效成份，且纯化后溶液中的残余活性炭不易去除。,31,石棉及活性炭吸附法,化学降解法是指用强酸、强碱或氧化剂等使内毒素降解以达到去除内毒素的目的，主要用于玻璃、塑料和其它高分子材料器皿上内毒素的去除。 缺点：这种方法有可能造成目标产物的流失、降解或失活，因此对于具有生物活性物质溶液中的内毒素去除显然是不利的。,32,化学降解法,离子交换色谱法是根据内毒素带有部分负
13、电荷的性质，用阴离子交换色谱来去除内毒素。 缺点：这种方法不适合于溶液中存在其它带负电荷物质的情况。,33,离子交换色谱法,亲和色谱法是利用物质的生物学特性来达到物质的分离，是去除内毒素的一种较为理想的方法。只要采用适当的配基，将它固载于亲和色谱的基质上合成出亲和介质，就可使它成为一种去除内毒素的高效能、高选择性方法。相对于上述方法来说，亲和色谱法具有其显著的优越性，去除率高、选择性好,34,亲和色谱法,由于生物制品（如干扰素、白介素、肿瘤坏死因子等，以及其它血液制品）在未来的基础研究和临床治疗中前景诱人，尤其是将具有治疗作用的蛋白质经生物工程技术在大肠杆菌中表达，所得到的产物中含内毒素相当丰富，故生物工程的药物生产面临着内毒素的去除问题。 从这一点看，制备无内毒素污染的生物制品具有很大的前景。,35,结语,Thank You !,36,
