《基因工程的基本操作程序的步骤》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基因工程的基本操作程序的步骤（34页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、用切目的基因相同的限制性内切酶切割质粒,目的基因,1.2基因工程的基本操作程序,专题1 基因工程,目的基因的检测与鉴定,基因工程的基本操作程序的步骤：,目的基因的获取,基因表达载体的构建,将目的基因导入受体细胞,阅读与思考,1、什么是目的基因？ 2、获取目的基因的方法有哪些？其操作过程分别是怎样的？,一、目的基因的获取,1、目的基因概念： 主要是指编码蛋白质的基因。 (人类所需要的基因，如：抗虫基因、胰岛素基因) 也可以是一些具有调控作用的因子。 2、目的基因获取的方法： 从基因文库中获取目的基因 利用PCR技术扩增目的基因 化学方法直接人工合成目的基因,（一）从基因文库中获取目的基因,基因文
2、库 定义（见课本P9）,种类,基因组文库,部分基因文库 （如cDNA文库）,基因组文库的构建过程,基因组文库,cDNA文库的构建过程,mRNA,单链DNA,双链DNA,cDNA文库,如何从基因文库中找到所需要的基因？,依据目的基因的有关信息。,如：根据 基因的核苷酸序列 基因的功能 基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质等特性。,（二）利用PCR技术扩增目的基因,PCR的全称： 聚合酶链式反应 PCR的原理： DNA复制(体外) PCR技术扩增目的基因的前提条件： 要有一段已知的目的基因的核苷酸序列。,模板 原料 引物 Taq酶 控制温度,目的基因DNA,四种脱氧核苷
3、酸,如单链DNA分子片段,热稳定的DNA聚合酶,PCR仪自动调控,PCR的条件：,（高温变性，低温复性，中温延伸）,PCR的过程：,目的基因DNA受热变性而解链 (90-95),引物与DNA单链互补结合(55-60),DNA聚合酶催化延伸合成新链(70-75),（高温变性，低温复性，中温延伸）,PCR技术与DNA复制的比较,（三）用化学方法直接人工合成,条件： 仪器：,基因较小，核苷酸序列已知。 DNA合成仪,二、基因表达载体的构建,复制原点+目的基因+标记基因+启动子+终止子,各元件具有怎样的功能？,1、元件：,启动子：,终止子：,位于基因尾端，转录停止的信号,位于基因首端，RNA聚合酶识别
4、和结合的部位，驱动基因转录出mRNA,2、基因表达载体的构建目的：,a.使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。 b.使目的基因能够表达和发挥作用。,载体与基因表达载体的区别：,同：二者均有标记基因和复制原点 异：表达载体在载体的基础上增加了目的基因、启动子、 终止子三部分结构 （其中启动子、终止子对于目的基因的表达（转录步骤）必不可少）,载体的组成： 复制原点+目的基因插入位点+标记基因,基因表达载体的组成： 复制原点+目的基因+标记基因+启动子+终止子,三、目的基因导入受体细胞,1、什么是转化？ 2、目的基因导入植物细胞常用的方法是什么？具体过程是怎样的？ 3、目的基因导入动
5、物细胞常用的方法是什么？基本操作程序是怎样的？ 4、目的基因导入大肠杆菌的方法是怎样的？钙离子有什么作用？,转化,目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。,1.目的基因导入植物细胞,常用的方法: 农杆菌转化法、基因枪法、花粉 管通道法,农杆菌的特点: a.易感染双子叶植物和祼子植物。 b.具有趋化性。 c.Ti质粒上的T-DNA可转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上,1.目的基因导入植物细胞,农杆菌转化法的导入过程:,构建基因表达载体,转入,农杆菌,植物细胞,导入,稳定维持和表达,.目的基因导入动物细胞,常用的方法: 显微注射技术 操作程序：,a.先提纯含目的
6、基因的表达载体 b.从动物体内取出卵(受精卵） c.显微注射仪进行显微注射 d.将含目的基因的受精卵移植到输卵管或子宫中发育成新个体,3.目的基因导入微生物细胞,原核生物的特点: 繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少。,大肠杆菌的转化过程:,用Ca2+处理细胞,增加细胞壁的透性，与细胞膜无关, 感受态细胞,重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合,感受态细胞吸收DNA分子,四、目的基因的检测与鉴定,1、导入目的基因后需要检测哪些方面？各采取什么方法？ 2、什么是DNA分子探针？检测时的DNA探针通过什么原理来检测目的基因和相应的mRNA？ 3、利用抗体抗原杂交检测的原理是什么？,目的基因是否插入
7、受体细胞染色体的DNA上？,检测1：,检测方法:,DNA探针：,用放射性同位素等作标记的含有目的基因的DNA片段。,DNA分子杂交技术,用DNA探针与基因组DNA杂交。,目的基因是否转录出mRNA？,检测2：,检测方法:,分子杂交技术,用DNA探针与mRNA杂交。,检测3：,检测方法:,抗原抗体杂交,目的基因是否翻译出蛋白质,4、个体生物学水平的鉴定,珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分，当它的成分异常时，动物可能患某种疾病，如镰刀型细胞贫血症，假如让你用基因工程的方法使大肠杆菌生产出鼠的珠蛋白，想一想，应该如何设计？,思考与探究,1.从小鼠中克隆出珠蛋白基因的编码序列（CDNA）。 2.将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。 3.将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出了大肠杆菌菌落，则表明珠蛋白基因已进入。 4.培养进入了珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取珠蛋白。,
