《肠球菌中βd葡萄糖苷酶分离纯化与酶学性质研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《肠球菌中βd葡萄糖苷酶分离纯化与酶学性质研究（92页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、分类号： Q 8 1 9 密级： 单位代码： 学 号： 1 0 4 3 l 1 0 4 3 1 0 7 0 8 6 山柬勉二案学院 硕士学位论文 肠球菌中J 3 一D 葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学 性质研究 作者姓名 专业 所在学院 指导教师姓名 专业技术职务 2 0 1 0 年0 6 月0 4 日 爱 ， t AT h e s i sS u b m i t t e df o rt h e A p p l i c a t i o no f t h eM a s t e r SD e g r e eo f E n g i n e e r i n g P u r i f i c a t i o na
2、 n dC h a r a c t e r i z a t i o no f p D - G l u c o s i d a s ei nE n t e r o c o c c u sf a e c i u m C a n d i d a t e ： Z h a n gH a o z h o n g S p e c i a l t y ：B i o c h e m i c a lE n g i n e e r i n g S u p e r v i s o r ： A s s o c i a t ep r o f e s s o rL i uT o n g j u n S h a n d o
3、n gI n s t i t u t eo fL i g h tI n d u s t r y , J i n a n ，C h i n a J u n e ，2 0 1 0 I 毫 导师签名：堑1 逮丝 日期：业卫一年月粤同 石 山东轻r 业学院硕f j 学位论文 目录 摘要I A B S T R A C T 一I 第1 章绪论1 1 1 银含提取物1 1 1 1 银杏提取物有效成分1 1 1 2 银杏提取物的临床应用2 1 1 3 银杏提取物的毒副作用4 1 1 4 银杏提取物有效成分分析方法4 1 1 5 银杏提取物展望4 1 2 肠球菌4 1 2 1 肠球菌的分类4 1 2 2 肠球菌
4、的生物学性质5 1 2 3 肠球菌的致病机理6 1 2 4 常见的肠球菌感染与疾病一6 1 2 5 肠球菌的治疗7 1 2 5 益生肠球菌的展望7 1 3 B D 一葡萄糖苷酶8 1 3 1B D 一葡萄糖苷酶的来源8 1 3 2B D 一葡萄糖苷酶的理化性质8 1 3 3 B D 一葡萄糖苷酶的催化机制9 1 3 4 B D 一葡萄糖苷酶的提取、分离纯化及酶活测定方法一l o 1 3 5B - D - 葡萄糖苷酶的应用1 1 1 3 6B D 一葡萄糖苷酶展望。1 3 1 4 研究内容与意义1 3 第2 章肠球菌培养条件优化研究1 5 2 1 材料与方法一1 5 2 1 1 实验材料1 5
5、2 1 2 方法1 7 2 2 结果与讨论1 8 2 2 1 测定肠球菌的生长曲线1 8 H 录 2 2 2 单因素实验1 9 2 2 3P l a c k e t t B u r m a n 实验设计2 2 2 2 4 最陡爬坡实验2 3 2 2 5 响应面( R S M ) 实验设计2 4 2 3 小结2 8 第3 章肠球菌1 3 - D - 葡萄糖苷酶活力测定条件的研究2 9 3 1 材料与方法2 9 3 1 1 材料与试剂2 9 3 1 2 方法一3 0 3 2 结果与分析3 l 3 2 1 对硝基苯酚一光密度标准曲线3 l 3 2 2 肠球菌中1 3 - D - 葡萄糖苷酶活性分析条
6、件的研究3 2 3 2 3 验证最优酶活测定条件3 5 3 3 小结3 6 第4 章肠球菌产1 3 - D - 葡萄糖苷酶条件优化3 7 4 1 材料与方法3 7 4 1 1 实验材料3 7 4 1 2 方法一3 8 4 2 结果与讨论3 9 4 2 1 基础产酶培养基的筛选3 9 4 2 2 基础产酶培养基组分优化4 0 4 2 3 发酵条件优化实验4 3 4 3 小结4 7 第5 章1 3 - D - 葡萄糖苷酶分离纯化及酶学性质探究4 9 5 1 材料与方法4 9 5 1 1 实验材料4 9 5 1 2 方法51 5 2 结果与讨论5 5 5 2 1 1 3 - D 一葡萄糖苷酶的分离纯
7、化一5 5 5 2 21 3 一D 一葡萄糖苷酶的基本性质5 7 5 3 小结6 l 第6 章结论与展望6 3 6 1 结论6 3 2 6 2 展望6 4 参考文献6 5 致 谢7 5 在学期间主要科研成果7 7 一、发表学术论文7 7 3 日录 4 山东轻T 业学院硕l ：学位论文 摘要 银含提取物( E G b 7 6 1 ) 含有2 4 银杏黄酮内酯( G i n k g o - f l a v o n eg l y c o s i d e s l 及6 萜类化合物( T e r p e n o i d s ) ，它可望成为治疗阿尔兹海默病( A l z h e i m e r s d
8、i s e a s e ，A D ) 的有效药，但是其临床前期试验，包括代谢等还没有能够按照药物 研发的现代标准来进行。银含提取物的代谢主要是通过肠道微生物菌群分泌的水 解酶来进行的，由此，本文选定肠球菌为模式菌株，通过系列研究不但能够初步 阐明机体代谢吸收银杏提取物中主要有效成分的酶学及分子生物学的机制，而且 为按照现代药物标准研发银杏系列产品做好方法上的准备并提供理论依据，因此 具有理论研究和实际应用双重重要意义。目前，国内外尚未见此方面成功的研究 报道。 首先通过响应面法优化设计得到了肠球菌最佳培养基配方为：葡萄糖 1 8 7 8 9 6 、酵母膏0 7 7 4 7 4 、牛肉膏0 3
9、、蛋白胨1 、K N 0 3 6 2 5m m o l L 、 N a C l 0 5 ，最适培养条件为：装液量6 0m L 、初始p H 7 0 、接种量3 、温度3 6 ， 接种后置于1 7 0r m i n 恒温摇床中培养2 0h 后，于O D 5 6 0 处测定吸光度值为0 7 4 8 ， 比优化前的0 6 8 2 提高了9 7 。 其次确定了肠球菌中p D 葡萄糖苷酶的酶活测定方法：在1 0 m L 具塞比色管 中加入1 5m L p H 5 0 的0 0 2m o l L 柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液，再用适当刻度的移 液枪吸取0 1m L 粗酶提取液加入其中，于4 5 恒温水浴中预热一
10、定时间，再加 入已预热5 1 0m i n 的0 4m L lm m o l L 底物p N P G 溶液，用秒表精确计时，1 4m i n 后取出立即加入2m L lm o l L 的N a 2 C 0 3 溶液终止反应，在比色管架上冷却至室温， 于4 0 0 n m 处测光吸收值。 再次通过单因素和正交实验对肠球菌产p D 葡萄糖苷酶的发酵条件进行了 优化，得到基础产酶培养基的最佳配比为：玉米粉3 ，酵母浸粉1 2 ，蛋白 胨1 ，葡萄糖2 ，K 2 H P 0 40 1 ，M g S 0 4 7 5m m o l L ；相应的最佳肠球菌产 酶发酵条件为：初始p H 7 0 ，发酵温度3 7 ，发酵时间1 6 8h ，摇床转速1 8 0r m i n ， 装液量5 0m L ( 2 5 0m L 三角瓶) ，接种量为3 ，此时肠球菌产D D 一葡萄糖苷酶的 酶活最高，达到1 9 1 2 4 2U ( m L m i n ) 。 肠球菌产p D 葡萄糖苷酶发酵液经过4 0 8 0 硫酸铵分级沉淀、D E A E 纤维素5 2 阴离子交换层析、S e p h a d e xG 1 0 0 凝胶过滤层析等步骤分离纯化得到 了p D 葡萄糖苷酶纯品，该酶的比活力由3 3 7U m g 提高到
