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1、核酸与核苷类药物概述及其合成工艺 第一节：概述 第二节：一些药物的制备工艺 及原理 第三节：核酸与核苷类药物制备举例,第一节 概述,一、核酸与核苷类药物 核酸与核苷类药物是指具有药用价值的核酸、核苷酸、核苷或者碱基 天然的、类似物、衍生物及其聚合物 作用： 影响生物的蛋白质合成和脂肪、糖类的代谢 恢复正常代谢或干扰某些异常代谢 用途：放射病、血小板减少症、白细胞减少症、急慢性肝炎、心血管疾病和肌肉萎缩、肿瘤、病毒病,核酸类物质药物一般可分为两大类： 一类具天然结构的核酸类物质， 另一类是自然结构碱基、核苷、核苷酸的结构类似物或聚合物。,前者是生物体合成原料或蛋白质、脂肪、糖生物合成与降解以及能
2、量代谢的辅酶，这一类药物有助于改善机体的物质代谢和能量平衡，加速受损组织的修复，促使缺氧组织恢复正常生理机能，临床上已广泛使用于放射病、血小板减少症、白细胞减少症、急慢性肝炎、心血管疾病、肌肉萎缩等病症的治疗，包括肌苷、辅酶A、GTP、CTP、UTP、ATP、腺苷、辅酶I、辅酶等，多数是生物体自身能够合成的物质，具有一定临床功能，毒副作用小，基本都可经微生物发酵或从生物资源中提取。,后一类药物是治疗病毒感染性疾病、肿瘤的重要手段，也是产生干扰素、免疫抑制的临床药物。 正式用于临床的抗病毒核苷类药物有三氮唑核苷、叠氮胸苷、阿糖腺苷等。,二、核酸与核苷的一般理化性质,核糖（核糖 脱氧核糖） 核苷
3、嘌呤（腺嘌呤、鸟嘌呤） 碱基 核酸 核苷酸 嘧啶（胞、尿、胸腺嘧啶） （DNA、RNA） 磷酸 DNA和RNA是存在于细胞中的正常成分。 DNA主要存在于细胞核中，少量（2%）存在于线粒体和叶绿体中； RNA主要存在于细胞质中，少量（10%）存在于核仁、核浆和染色体中。 核酸的含量与细胞大小无关，以生长旺盛的组织细胞中含量较多，如动物胰脏、脾脏、胸腺，植物的茎尖、根尖及各种分生组织等。,第二节 一些药物的制备工艺及原理,一、RNA的提取与制备 工业用RNA的提取 （1）RNA及其工业来源：从微生物中提取RNA是工业上最实际和有效的方法。一些最常见的菌体含有丰富的核酸资源，如酵母、白地霉、多种抗
4、菌素的菌丝体青霉素，制霉菌素等菌体。 通常在细菌中RNA占525，在酵母中占2.715，在霉菌中占0.7%28。,在菌体内RNA含量的变化受培养基组成影响，其中关键是铵离子浓度和磷酸盐浓度。培养酵母菌体收率高，易于提取RNA。 很显然在许多酵母中，早期细胞中的RNA含量高，其确切数值取决于碳、氮比例和培养基组成等。 （2）高RNA含量酵母菌株的筛选 可以从自然界筛选到RNA含量高的酵母菌株，也可用诱变育种的方法提高酵母菌的RNA含量。,稀碱法：是用氢氧化钠溶液（1%），使细胞壁变性，使核酸从细胞内释放出来。需用酸中和PH7。然后除去菌体，将pH调至RNA的等电点（pH2.5），使RNA沉淀出来
5、。上法的缺点是制得的RNA Mr较低,(磷酸单脂酶、磷酸二脂酶降解RNA，90 保持34h破坏酶)。 浓盐法：是用高浓度盐溶液（6%8%）处理，同时加热，以改变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内释放出来。 要避免分子降解，可采用苯酚法制备RNA。用苯酚处理生物材料，使蛋白质变性，然后离心，上层水溶液内含有全部RNA，可用乙醇沉淀出来。脱氧核糖核蛋白溶于浓盐溶液1mol/L,不溶于0.14mol/L,而核糖核蛋白溶于0.14mol/L盐溶液。,（3）RNA的提取实例： 啤酒酵母是提取RNA的很好的资源。取100g压榨啤酒酵母（含水份70%），加入230ml含NaOH 3g的水，20以下缓慢搅拌30分
6、钟。用6molL HCl调至pH7，搅拌15分钟，离心得清液255m1。冷至10以下，6molL HCl调pH2.5，置冷过夜，离心得RNA l.8g（纯度80）。,RNA提取实例： 提取 中和 HCl 酸化、沉淀HCl 酵母 提取液 上清液 RNA NaOH、水 pH 7、离心 pH 2.5、离心,二、DNA的提取与制备 工业用DNA的提取 取新鲜冷冻鱼精20kg，用绞肉机粉碎2次成浆状，加入等体积水，搅拌均匀，倾入反应锅内，缓慢搅拌，升温至100，保温15分钟，迅速冷却至2025，离心除去鱼精蛋白等沉淀物，获得35L含热变性DNA的溶液，经精确测定DNA含量后直接可用于酶法降解生产脱氧核苷
7、酸。如要制成固体状DNA，在热变性DNA溶液中逐渐加入等体积95乙醇，离心可获得纤维状DNA，沉淀用乙醇、丙酮洗涤，减压低温干燥得DNA粗品，产品含热变性DNA5060。,工业用DNA的提取 提取 热变性 沉淀乙醇 鱼精 提取液 纤维状DNA 水、100 冷却、离心 70%-80% （无生物活性） 15min 干燥 粗品DNA（热变性后无活性）,具有生物活性DNA的制备 动物内脏（肝、脾、胸腺）加4倍重量生理盐水经组织捣碎机捣碎1分钟，匀浆于2500rpm离心30分钟，沉淀用同样体积的生理盐水洗涤3次，每次洗后离心，将沉淀悬浮于20倍重量的冷生理盐水中，再捣碎3分钟，加入2倍量5的（用45%乙
8、醇作溶剂）十二烷基磺酸钠，并搅拌23小时，在02500rpm离心，在上层液中加入等体积的冷95乙醇，离心即可得到纤维状DNA，再用冷乙醇和丙酮洗涤，减压低温干燥得粗品DNA。粗品DNA溶于适量蒸馏水，加入5十二烷基磺酸钠达110体积，搅拌1小时，经5000rpm离心1小时，清液中加入NaCl达1molL，再缓慢加入冷95%乙醇，DNA析出，经乙醇、丙酮洗涤，真空干燥得具有生物活性的DNA（活性DNA制备需在03操作）。,生物活性DNA的制备 提取 洗涤3次 5%SDS 动物内脏 沉淀 沉淀 上层液 （肝、脾）生理盐水 生理盐水 再捣碎 离心、30min 沉淀 洗涤、干燥 提取 纤维状DNA 粗
9、品DNA 上清液 95%乙醇 冷乙醇、丙酮 水、5%SDS 离心 沉淀 洗涤、干燥 DNA沉淀 活性DNA NaCL、95%乙醇 乙醇、丙酮,三、用酶解法、发酵法和半合成法制备核苷酸 1、酶解法及碱水解法制备核苷酸 酶解法制备脱氧核苷酸 桔青霉产生5-磷酸二脂酶 红酵母产生3-磷酸二脂酶,酶解法制备戊糖核苷酸 我国从60年代开始使用核酸酶P1降解核糖核酸生产单核苷酸，日本年产呈味核苷酸（肌苷酸和鸟苷酸）3000吨，其中60%是使用酶解法生产的。 酶解法生产5单核苷酸工艺流程,双酶法生产肌苷酸和鸟苷酸（IG） 呈味核苷酸的主要品种是肌苷酸钠和鸟苷酸钠，商品名简称为（IG），用核酸酶Pl降解RNA
10、可获得GMP和AMP，其中AMP经脱氨生成IMP。双酶法生产（I十G）工艺 。,菌体自溶法生产核苷酸 磷酸二酯酶在合适的条件下降解细胞内的RNA可产生5-核苷酸。在国内用谷氨酸产生菌体自溶法生产5-核苷酸。 （1）菌体自溶法生产核苷酸工艺流程：,碱水解法生产2，3-混合核苷酸 RNA结构中的磷酸二酯键对于碱性条件不稳定，很容易生成2，3 -环状磷酸酯，此环状磷酸酯对碱更不稳定，很易加水分解生成2，3-混合核苷酸。取RNA配成33.5%的水溶液，加氢氧化钠达0.3molL浓度，升温至38，保温1620小时，用6molL盐酸中和至pH7.0，从RNA水解成2，3-核苷酸的降解率达95以上，将2，3
11、-混合核苷酸制成每片含50100mg的片剂，经临床使用，对非特异性血小板减少症、对白血球减少症、癌肿的化疗和放疗后的升白血球均有较好疗效。,发酵法生产核苷酸 1、发酵法生产肌苷酸（IMP） 肌苷酸钠是一种高效增鲜剂，在谷氨酸钠（味精）中加2%，鲜度可增加3倍。因此，在味精中添加肌苷酸钠（或鸟苷酸钠）后成为第二代特鲜味精。 产氨短杆菌嘌呤核苷酸生物合成途径、代谢调控和肌苷酸发酵机制:,积累IMP的主要前提： （1）阻断SAMP合成酶: 即选育缺该酶的菌株（嘌呤缺陷型），发酵前期提供适量腺嘌呤，以满足菌体生长； （2）保持 PRA 合成畅通，即后期没有多余腺嘌呤阻遏该步反应； （3）要使IMP渗出
12、胞外，选育对Mn+不敏感菌株； （4）生成的IMP不被降解，恰好原菌株该酶活力低。,2、混合培养法发酵生产鸟苷酸（GMP）: 直接发酵法生产GMP必需满足以下条件 （1）解除GMP的反馈抑制（与GMP积累相勃）; （2）改变细胞对GMP的透性; （3）不分解生成GMP 只能先合成XMP，后转化为GMP： 方法如下： 选育鸟嘌呤、腺嘌呤缺陷型菌株，同时解除PRPP转酰胺酶及XMP合成酶的阻遏，积累大量XMP(GMP合成酶及SAMP合成酶缺失）。,XMP转化为GMP菌株的条件: (1)GMP不被分解 (2)GMP合成酶活力要强化(抗生素激动剂) (3)增加细胞通透性,半合成法制备核苷酸 由于发酵法
13、生产核苷的产率很高，核苷悬浮于磷酸三甲酯或磷酸三乙酯中，在冷却条件下加入氯化氧磷，进行磷酸化，从核苷生成5-核苷酸收率可达90%。 例一：肌苷2mmolL悬浮于5ml磷酸三乙酯中，温度控制0，添加氯化氧磷6mmolL，水2mmolL，反应2h，5-IMP摩尔产率达91。 例二：鸟苷2mmolL悬浮于5ml磷酸三甲酯中，温度控制0，添加氯化氧磷6mmolL，水2mmo/L，反应6h，5-GMP摩尔产率达90%。,四、核苷的制备 核苷是多种核苷类药物的原料，在核酸类药物中占主导地位。 （1）以核苷及其结构类似物、衍生物为主药物多达几十种； （2）核苷类药物在抗病毒、抗肿瘤、增强免疫方面占重要地位；
14、 （3）核苷的发酵水平大大高于核苷酸，所以常做后者的前体物质。 1、RNA化学水解法制备核苷：,2、发酵法生产核苷 产率高、周期短、控制容易、产量大。 共同特点： （1）使用磷酸单酯酶活力很强的枯草芽孢杆菌或短小芽孢杆菌为诱变出发菌株； （2）具有特定标记的有变株； （3）发酵培养时需提供限量生长因素。 原菌株： （1）AMP强烈抑制PRPP转酰胺酶的活性，控制总代谢途径； （2）AMP抑制SAMP合成酶； （3）GMP抑制IMP脱氢酶,生产菌株： （1）酶6、7缺失（为腺嘌呤缺陷型）积累IMP-肌 苷（肝炎辅助药）； （2）酶4缺失（为鸟嘌呤缺陷型）积累XMP-黄苷； （3）酶5缺失积累鸟苷
15、。,发酵法生产肌苷 （1）肌苷生产工艺 （2）发酵工艺条件： 碳源为葡萄糖 保证充足的氮源 磷酸盐的影响 Mg+、Ca+有促进作用 生长因子腺嘌呤或酵母粉要亚适量 最适发酵温度为30-34，pH6.06.2 需大风量,高溶氧和低CO2,发酵法生产肌酐的工艺流程,发酵法生产鸟苷和黄苷 鸟苷产生菌的特征： （1）嘌呤核苷酸分解酶活力强； （2）SAMP合成酶，GMP还原酶缺失； （3）解除AMP、GMP对PRPP转酰胺酶，肌苷酸脱氢酶和GMP合成酶的反馈抑制；,发酵法生产腺苷 以肌苷生产菌（枯草杆菌）为诱变基础菌株。 诱变结果： （1）腺嘌呤回复，腺嘌呤酶缺失； （2）黄嘌呤缺陷型，GMP还原酶缺失； （3）抗8杂氮黄嘌呤解除对PRPP转酰胺酶的抑制； （4）发酵不稳定的原因：黄嘌呤缺陷及腺嘌呤酶缺失与回复（菌种传
