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1、第八章 分子育种,一、分子育种的概念与程序,概念 按照人们的愿望，进行严密的设计，通过体外 DNA重组技术 和 DNA转移技术，有目的地改造生物种性，使现有物种在短时间内趣于完善，以创造出新的生物类型的技术体系 ，亦即基因工程。,2.植物基因工程,植物基因工程是近20年来随着DNA重组技术、 植物遗传转化技术及植物组织培养技术而发展起来的现代生物技术。,3. 基因工程的基本步骤,目的基因的获取,基因载体的选择与构建,目的基因与载体的拼接,重组子导入受体分子,外源基因的表达和产物的分离,重组子的检测,4. 观赏植物基因工程的目的基因,1、观赏性 开花、花色、花型、花径相关基因。 2、抗逆性 抗虫
2、、抗旱、耐盐碱、抗寒相关基因 3、切花寿命 4、花期调控,二、基本技术及原理,（一）DNA重组技术 将外源DNA片段与载体分子连接，形成重组DNA分子，再将重组子导入寄主细胞内。这一技术体系称为DNA重组技术。,DNA 重 组 技 术,（二）基因工程的基本概念,1. 转化（Transformation)： 是指将外源DNA导入受体细胞的过程。 2. 复制子（Replicon)： 具有一个复制起点 (ori) 的DNA分子称为一个复制子。 3. 载体（Vector）： 能与外源DNA连接并实现转化的复制子。 4. 重组子（Recombinant）： 连接了外源DNA分子的复制子。,（三）基因工程
3、的工具酶,限制性内切酶（restriction endonuclease) DNA连接酶（ligase) 末端修饰酶,（五）基因工程的载体系统,1、质粒载体 2、噬菌体载体 3、病毒载体,质粒图谱及质粒构建 启动子 外源基因 终止子 启动子 报告基因 终止子 （标记基因） 目的片段 选择标记 载体,(六) 植物基因工程的报告基因,定义 特点 在选择培养基上生长 报告基因与目的基因嵌和表达 研究调控区,报告基因的种类 新霉素磷酸转移酶（ Neomycine phosphotransferase II, NPT II)基因 氯霉素乙酰基转移酶（Chloraphenicol acetyltransf
4、erase, CAT）基因 潮霉素磷酸转移酶（Hygromycin phosphotransferase, Hpt）基因 葡萄糖酸苷酶 （ Glucuronidase, GUS）基因 荧光素酶（Luceferase, Luc）基因 抗除草剂（Basta, Bar）基因,三、转基因操作的方法,(一)外源DNA导入植物细胞的方法,载体介导的转化方法 DNA直接导入法 种质系统法,外源DNA导入植物细胞的方法,1、致癌农杆菌介导的Ti质粒载体转化法 2、病毒介导的基因转移 3、基因枪介导的基因转化 4、PEG诱导的基因转化 5、脂质体介导 6、电激法介导 7、超声波介导 8、显微注射 9、激光微束
5、10、种质系统介导基因转化法,1、致癌农杆菌介导的Ti质粒载体转化法,含有Ti质粒的致癌农杆菌与一些植物的细胞接触后，Ti质粒的一部分（T-DNA）可以导入植物细胞，整和到植物基因组DNA随其复制。根据这一特性可构建一系列Ti质粒载体， 与含目的片段的DNA片段重组，导入致癌农杆菌，再采用叶盘法、原生质体培养法、细胞培养法，通过致癌农杆菌介导进入植物细胞。,根瘤农杆菌及Ti质粒,Ti质粒 根瘤农杆菌染色体外的遗传物质，为共价闭合环状的DNA分子。,Ti质粒的功能 为农杆菌提供附着于植物细胞壁的能力； 参与寄主细胞合成激素的能力； 诱发植物产生冠瘿瘤； 赋予寄主分解冠瘿碱的能力； 决定寄主范围。
6、,Ti质粒的结构 T-DNA区 Vir 区 Con 区 Ori 区,Vir 区,E,Ti Plasmid,T-DNA区,Ori 区,Con 区,Vir 区操纵子的基因结构与功能 Vir区是一段长度为35KB操纵子 包含六个基因： VirA、VirB 、 VirC 、 VirD 、 VirE 、 VirG。,T-DNA的结构与功能,植物遗传转化的载体系统,一元载体（顺势载体）,双元载体（反式载体）,农杆菌介导的转化质粒的构建,P G2 T NOS,Ampr P G1 T,Vir区,农杆菌导入方法,共培养法 叶盘转化法 整株感染法 原生质体共培养法,2、基因枪介导的转基因操作,基本原理 操作步骤
7、优点 影响转化效率的因素,Bio-Rad Biolistic DS-1000/He and Hepta System,Bio-Rad Biolistic DS-1000/He and Hepta System,操作步骤 预培养 转基因操作 转基因植株筛选和培养 转基因植株的鉴定 田间释放,影响转化效率的因素 金属微粒 DNA沉淀辅助剂 DNA纯度和浓度 微弹速度 植物材料,基因枪法的优点 无宿主限制； 靶受体类型广泛； 可控度高； 操作简便。,问题： 转化效率低； 嵌合体多； 稳定性差，瞬时表达； 外源基因沉默； 整合机理不详。,3、PEG诱导的基因转化,聚乙二醇（PEG）、多聚鸟苷酸、磷酸钙
8、在高PH值条件下诱导原生质体扑获DNA分子。,步骤： 共保温； 稀释PEG； 非选择培养； 选择培养。,优点： 转化顺利，对细胞伤害小； 避免嵌合体的生成； 易于选择； 便于进行理论研究； 受体广泛。,4、脂质体介导,用化学物质将DNA包裹成球体，通过植物原生质体的吞噬作用，把DNA导入细胞。,5、电激法介导,利用高压脉冲作用，在原生质体上形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的摄取。,6、超声波介导 7、显微注射 8、激光微束,9、种质系统介导法,生物媒体转化系统,(二) 转基因操作的受体系统,1、高频再生体系的建立 愈伤组织再生系统 直接分化再生系统 原生质体再生系统 胚状体再生系统 生殖
9、细胞再生系统,2、抗生素敏感实验 抑制细菌生长 杀死非转化细胞 3、农杆菌敏感实验,(三) 转化细胞的培养和转基因植株的再生,恢复生长 筛选培养 植株再生,四、转基因植物的鉴定,遗传鉴定 表达鉴定 表型分析鉴定,利用报告基因 Northern 杂交 Western 杂交,直接鉴定DNA分子是否整合到基因组上。 1）扩增目的片段； 2）杂交信号鉴定。 （Southern 杂交）,鉴定步骤： 筛选鉴定（利用质粒上的选择标记） 报告基因鉴定（利用质粒上的报告基因） 遗传鉴定 生长试验,Southern DNA印迹杂交,植物遗传转化流程,适宜外植体的选择及再生体系的建立,抗生素筛选压的确定及农杆菌菌株
10、的选择,遗传转化操作,载体介导的 转化方法 DNA直接导入法 种质系统法,选择培养,转基因植株鉴定,获得再生植株,转化质粒的构建,转基因植株的繁殖与应用,利用报告基因 Southern 杂交 Northern 杂交 Western 杂交,五、基因工程的安全性,（一）安全问题的考虑 工程菌株的处理 转基因植物的释放 转基因产品的安全,1.转基因作物本身成为杂草； 2.转基因作物使其亲缘野生种成为杂草或超级杂草； 3.转基因作物可能产生新的病毒或疾病； 4.转基因作物对非目标生物的危险； 5.转基因作物作为外来种对新生境的入侵，使生物多样性受到威胁； 6.转基因作物对生态系统及生态过程的影响； 7
11、. 其它一些不可预计的风险。,（二）转基因植物的风险,（三）生物安全的管理,法国为对遗传修饰生物体(GMO)的评价和立法成立了两个专门委员会。 第一个是遗传工程委员会，成立于1975年，任务集中于实验室的重组DNA的研究； 1986年又成立了生物分子工程委员会，它的任务是评价遗传修饰生物体的大田试验、释放以及商品化过程的安全问题。,进入90年代特别是1992年联合国环境与发展大会的召开，更加促进了国际上对生物安全立法工作的重视，特别是大会由许多国家签署的两个纲领性文件21世纪议程和生物多样性公约均在有关条款中提到了生物技术安全问题。,1993年，在原国家科学技术委员会领导下成立了国家生物遗传工
12、程安全委员会，由来自卫生部、农业部、轻工业部的专家组成，负责医药、农业和轻工业部门的生物安全。 目前，在中国负责生物安全的部门有国家环保总局、科技部、农业部、卫生部、国家医药管理局、中国科学院和教育部等。,1996年7月10日农业部颁布的农业生物基因工程安全管理实施办法是一部较完善、较好的“实施办法”。,农业转基因生物安全管理条例 中华人民共和国国务院令 第304号 农业转基因生物安全管理条例已经2001年5月9日国务院第38次常务会议通过，现予公布，自公布之日起施行。 总 理 朱镕基 2001年5月23日,植物基因工程,一、植物基因工程的载体 二、植物基因工程的报告基因 三、基因转化的受体系统 四、外源DNA导入植物细胞的方法 五、转化细胞的培养和植株的再生 六、外源基因在转基因植物中的表达 七、转基因植物的鉴定技术 八、转基因植物的释放,
