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1、逆转录PCR概念逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶 H降解，留下互补DNA。RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。RT-P
2、CR广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。（检测基因表达的方法，参见Northern Blot法）RT-PCR有时候也会指代实时PCR(real-time PCR)。为了与逆转录PCR相区别，通常被写作“定量PCR”(quantitative PCR)或者RTQ-PCR(real-time quantitative PCR)。PCR技术相关试剂A液：变性液 B液：醋酸钠溶液 C液：酚氯仿异戊醇混合液（50：49：1） D液：异丙醇 E液：75乙醇 F液：DEPC处理的灭菌去离子水 G液：RNA酶抑制剂 H液：反转录反应液 I液：反转录酶 J液：PCR反应液 K液：Taq
3、 DNA聚合酶(0.5uµl) L液：矿物油 M液：50倍TAE电泳缓冲液 N液：溴化乙锭溶液 0液：上样缓冲液PCR各步骤的目的（一）预变性：破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构。 使DNA充分变性，减少DNA 复杂结构对扩增的影响，以利于引物更好的和模板结合，特别是对于基因组来源的DNA模板，最好不要吝啬这个步骤。此外，在一些使用热启动Taq酶的反应中，还可激活Taq酶，从而使PCR反应得以顺利进行。（二）变性-退火-延伸循环：模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反
4、应作准备；模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。（三）用PCR仪扩增时,(变性.退火,延伸)循环完成后,继续72度延伸了10分钟的原因：1.延伸时间取决于待扩增DNA片段的长度。（当然是在反应体系一定的条件下）例如，使用taqDNA聚合酶，72度时的碱基掺入率为35-100bp/s，因此延伸速率为1kb/min。2.根据延伸速率推得，扩增1
5、kb以内的dna片段1min即可，而3-4kb则需要3-4min，依次照推。通常在最后一轮要适当的将延伸时间延长至4-10min，这样做是使pcr反应完全以提高扩增产量。3.继续72度延伸了10分钟除了可以使pcr反应完全以提高扩增产量外，还有一个作用是：在用普通taq酶进行PCR扩增时在产物末端加A尾的作用，可以直接用于TA克隆的进行。1缓冲液标准的缓冲液含 10mM TrisHCl ， pH 为 8.3-9.0（室温），而在延伸温度（72 ）下，pH 值接近 7.2 。缓冲液中含有一种二价阳离子，用于激活 DNA 聚合酶的活性中心，一般使用 Mg2 ，有时使用 Mn2 。一般以 MgCl2
6、 的形式提供，标准浓度为 1.5mM 。 Mg2 浓度的高低会影响扩增的特异性和产率。缓冲液中还含有 50mM 的钾离子。有些缓冲液中还加入一些添加剂和共溶剂可降低错配率，提高富含 G C 模板的扩增效率。 2脱氧核苷三磷酸（dNTP）脱氧核苷三磷酸是 DNA 合成的底物，标准的 PCR 反应体系中含有等摩尔浓度的 4 种 dNTP ，即 dATP、dTTP、dCTP 和 dGTP ，终浓度一般为 200mM（即饱和浓度）。 dNTP 的浓度会影响扩增的产量、特异性和忠实性。 3引物在多数试验中人们习惯使用的引物浓度为各 1mM ，即 1pmol/ml ， 在 100 l 反应体系中相当于6x
7、1013个分子。如果 5% 用于扩增 1kb 的 DNA 片段，可得到 3.3 g 的产物，足以用于常规分析。 引物设计一般要考虑以下几个问题： 长度：至少 16bp ，通常为 18-30bp ，更短的引物一般会降低扩增的特异性，但会提高扩增的有效性。 引物的解链温度：两个引物之间的 Tm 值差异最好在 2-5 。对于小于 20 个碱基的引物其 Tm 值可用简易公式计算，即 Tm=4（G C） 2（A T）。 对于 14-70 个核苷酸的引物可用以下公式计算。Tm=81.5 16.6（1gK ） 0.41（G C）%-（675/N）N 表示引物的核苷酸数目， K 表示单价离子即钾离子的浓度。
8、避免引物内部或引物之间存在互补序列（3个碱基），从而减少引物二聚体的形成以及引物内部二级结构的形成。 G C 含量：尽量控制在 40% 至 60% 之间， 4 种碱基的分布应尽可能均匀。尽量避免嘌呤或嘧啶的连续排列，以及 T 在 3 末端的重复排列。 引物的 3 末端最好是 G 或 C ，但不要 GC 连排。4模板模板的数量会直接影响扩增的效果。对于一般的 PCR 扩增，104至107个模板分子可达到满意的效果。用人类或哺乳动物基因组 DNA 进行扩增时，一般使用 1g DNA , 相当于单拷贝基因有 3105 个拷贝。以酵母菌、细菌、质粒和 M13 噬菌体噬菌斑的 DNA 作模板时，要达到这
9、么多拷贝数分别需要 10ng，1ng，1pg 和 1% 噬菌斑。 5DNA 聚合酶 Taq DNA 聚合酶来自嗜热古细菌的嗜热水生菌（Thermus aquaticus）， Taq DNA 聚合酶分子量大小为 94kDa ，为单分子酶，在 75 活性最强。具有 5-3 合成活性和 5-3 外切活性 , 但是无 3-5 外切活性。在 95 的半衰期为 40 分钟。启动 PCR 反应的能力很强，聚合速度快，在 72 的聚合速度为每秒 30-100 碱基。由于没有 3-5 外切活性，在扩增过程中有 8.9-11x10 -5 的错配几率。 Tth DNA 聚合酶Tth DNA 聚合酶来自嗜热热细菌（T
10、hermus thermophilus）HB8 ，由 Promega 公司开发成商品。 Tth DNA 聚合酶分子量为 94kDa ，在 74 进行扩增，在 95 的半衰期为 20 分钟。 在 Mg2 存在下，条件下以 DNA 为模板合成 DNA ，而在 MnCl2 存在下可以 RNA 为模板合成 cDNA 。因此可在高温下做 RT-PCR 、反转录和引物延伸（primer extension）反应， 避免 RNA 反转录过程中形成的二级结构。 Vent DNA 聚合酶Vent DNA 聚合酶是从由火山口分离的嗜热球菌 Thermococcus litoralis 中分离的第一个具有 3-5
11、外切活性的高温 DNA 聚合酶，由 New England Blabs 公司开发出商品。酶分子为 85kDa ，具有更长的半衰期，在 100（使用 MgSO4）时，其半衰期为 1.8 小时。 Pwo DNA 聚合酶Pwo DNA 聚合酶来自 Pyrococcus woesei（BM），大小为 90kDa ，由原德国宝灵曼公司开发。在 100 的半衰期大于 2 小时，出错率低。是使用较多的具有 3-5 外切活性的且具有高保真度的 PCR 酶。 Pfu DNA 聚合酶Pfu DNA 聚合酶来自激烈热球菌（Pyrococcus fariosus），具有理想的扩增保真度，具有极高的热稳定性，是目前使用
12、最广泛的具有 3-5 外切活性的 PCR 酶。 商用混合酶为了提高扩增的保真度或扩增较长的 DNA 片段，将 Taq DNA 聚合酶的强启动能力和具有 3-5 外切活性的高温 DNA 聚合酶的高持续活性和校正功能结合起来，可以达到很好的效果。 PCR反应体系与反应条件 作者：佚名 文章来源：本站原创 点击数：794 更新时间：2008-8-18 10:35:18 标准的PCR反应体系： 10扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 各10100pmol 模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ul
13、PCR反应五要素： 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+引物： 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则：引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶 核苷酸的成串
14、排列。避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。引物3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量： 每条引物的浓度0.11umol或10100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。酶及其浓度目前有两种Taq DNA聚合酶供应， 一种是
15、从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2。5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.07.5，小量分装， -20冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。
