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1、我带领班子成员及全体职工，积极参加县委、政府和农牧局组织的政治理论学习，同时认真学习业务知识，全面提高了自身素质，增强职工工作积极性，杜绝了纪律松散第10课时分子生物学技术学习导航1.结合教材了解PCR技术的基本操作。2.理解PCR扩增DNA片段的原理。3.结合教材，尝试进行目的DNA片段的体外扩增。重难点击1.了解PCR技术的基本操作。2.理解PCR的原理。一、使用PCR仪的安全措施和PCR反应程序1.DNA分子的结构(1)写出各个标号的名称：胞嘧啶；腺嘌呤；鸟嘌呤；胸腺嘧啶；脱氧核糖；磷酸基团；胸腺嘧啶脱氧核苷酸；氢键；碱基对；一条脱氧核苷酸链。(2)DNA的两条链是反向平行的，为了明确表
2、示DNA链的方向，通常将DNA的羟基末端称为3端，将磷酸基团的末端称为5端，按此原则在图上方框内标出两条链的方向。答案左链上5端，下3端；右链上3端，下5端。2.细胞内DNA复制条件分析条件组分作用模板DNA的两条单链提供复制的模板原料四种脱氧核苷酸合成DNA子链的原料酶解旋酶打开DNA双螺旋DNA聚合酶催化合成DNA子链能量ATP为解螺旋和合成子链供能引物RNA为DNA聚合酶提供合成的3端起点3.PCR技术(1)概念：在体外快速扩增特定基因或DNA序列(目的DNA片段)的技术称为PCR技术。(2)物质条件：DNA模板、四种脱氧核苷酸、TaqDNA聚合酶、引物。(3)PCR反应的过程及结果PC
3、R反应程序a.变性：在94 高温下，作为模板的双链DNA解旋成为单链DNA。b.退火(复性)：反应体系的温度降至55 ，引物与作为模板的单链DNA上的特定部位相互配对。c.延伸：反应体系的温度回升到72 左右，按照单链DNA上的脱氧核苷酸序列，4种脱氧核苷酸根据碱基互补配对原则，在TaqDNA聚合酶的作用下连接到引物之后，使引物链延伸，形成互补的DNA双链。结果a.PCR扩增一般要经历三十多次循环，每次循环都包括变性、退火、延伸三步。b.两引物之间的固定长度的DNA序列呈指数扩增。1.PCR原理PCR反应与体内DNA复制的引物在化学本质上是否相同？请分析原因。答案不相同。体内DNA复制所需引物
4、为RNA聚合酶合成的一小段RNA，但PCR反应时所用引物一般是人工加入的一小段单链DNA。2.PCR反应过程(1)PCR反应中需要解旋酶和DNA聚合酶吗？若需要，则与细胞内DNA复制有何区别？答案PCR反应不需要解旋酶，但需要DNA聚合酶。由于PCR反应中需要高温使DNA解旋，因此PCR所需的DNA聚合酶能耐高温。(2)PCR的每次循环中应如何控制温度？请分析原因。答案每次循环中先高温解旋，再低温使引物与模板结合，最后适当升温有利于Taq DNA聚合酶发挥作用。(3)结合下图分析PCR过程中DNA复制的方向是怎样的？答案DNA的羟基(OH)末端为3端；磷酸基团的末端为5端。当引物与DNA母链通
5、过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5端向3端延伸。归纳总结PCR扩增与DNA复制的异同项目DNA复制PCR扩增不同点时期有丝分裂间期或减数第一次分裂的间期任何时期场所活细胞内细胞外酶解旋酶、DNA聚合酶耐高温的Taq DNA聚合酶引物有转录，产生RNA作引物，无需人工加入无转录，无引物产生，需人工加入两种DNA引物特点边解旋边复制先全部解旋后开始复制缓冲液不需缓冲液配制缓冲液代替细胞核液设备无控制温度变化的温控设备相同点原理严格遵循碱基互补配对原则引物都需要分别与两条模板链相结合的两种引物模板DNA的两条链为模板特点半保留复制原料游
6、离的四种脱氧核苷酸1.下列关于DNA复制和PCR技术的描述中，正确的是()A.DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从5端延伸DNA链B.DNA复制不需要引物C.引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合D.PCR扩增的对象是氨基酸序列答案C解析DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，故DNA复制需要引物。DNA聚合酶只能从3端延伸DNA链，而不能从5端延伸DNA链。引物通过碱基互补配对原则与DNA母链相结合。PCR扩增的对象是DNA，不是氨基酸序列。2.PCR技术有效地解决了因为样品中DNA含量太低难以对样品进行研究的问题，而被广泛应用，与细胞内的DNA复制相比，PCR可以快速扩增所需的DNA片
7、段，请分析回答下列有关问题：(1)体内DNA复制过程中用解旋酶打开双链DNA，而PCR技术中的解旋原理是 。(2)此过程需要一种Taq DNA聚合酶。该酶是从 中分离的。(3)与普通DNA聚合酶相比，Taq DNA聚合酶具有的特性是 。(4)与体内DNA复制相比较，PCR反应要在 中才能进行，并且要严格控制 条件。(5)PCR中加入的引物有 种，加入引物的作用是 。答案(1)DNA的热变性原理(2)水生耐热细菌Taq(3)耐高温(4)一定的缓冲溶液温度(5)2作为DNA复制的起点解析(1)PCR技术中用高温使DNA分子中的氢键打开，从而解旋，其原理是DNA的热变性原理。(2)Taq DNA聚合
8、酶是从水生耐热细菌Taq中提取的。(3)与普通DNA聚合酶相比，Taq DNA聚合酶在90 以上的环境中不变性，具有耐高温的特性。(4)PCR反应需要适宜的温度和pH，因此PCR反应要在一定的缓冲溶液中进行，并需严格控制好温度条件。(5)PCR需要两种引物，引物的识别位点决定了PCR扩增的DNA片段。PCR中加入的引物一般是一小段单链DNA，作用是引导DNA复制，可以使游离的脱氧核苷酸与之结合形成磷酸二酯键，成为DNA复制的起点。一题多变细胞内的DNA复制需要适宜的温度和pH吗？若需要，是如何实现的？答案需要。细胞内的适宜温度和pH与内环境的稳态有关，低等生物与环境因素有关。易错提醒与PCR原
9、理有关的三个易错点(1)酶的作用位点：解旋酶的作用是使DNA两条链之间的氢键断开；DNA聚合酶与DNA连接酶的作用都是催化形成磷酸二酯键。不要误认为解旋酶也作用于磷酸二酯键。(2)DNA聚合酶和DNA连接酶：DNA聚合酶是将单个核苷酸连接到已有的单链片段的3端上，需要模板；而DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口，不需要模板。(3)PCR中的解旋过程：PCR过程中不需要解旋酶，需要升高温度才能打开氢键，但此时的温度不会破坏磷酸二酯键，因此，DNA加热变性后变为单链，并未分解成单体。二、目的DNA片段的体外扩增与鉴定1.DNA片段的PCR扩增(1)准备器材：PCR仪、台式高速离心机、0.2 m
10、L PCR微量离心管、自动取液器、模板DNA等。(2)在0.2 mL PCR微量离心管中加入5 L 10倍浓缩的PCR缓冲液，4种脱氧核苷酸的溶液各5 L,1 L模板DNA,5 L引物1和5 L引物2,29 L双蒸水。(3)煮沸5 min之后冰浴2 min，低速离心，按照1单位/L加入TaqDNA聚合酶。(4)扩增DNA片段的反应程序：将微量离心管放入PCR仪中，盖上样品池盖。在94 的条件下预热5 min，再设置反应程序为：94 ，30 s55 ，30 s72 ，1 min(以上过程循环30次)。最后一次延伸条件为72 ，1 min。(5)按照PCR仪器操作要求运行反应程序。2.DNA分子的
11、测定(1)配制二苯胺试剂：分别配制A液(1.5 g二苯胺溶于100 mL 冰醋酸中，再加入1.5 mL浓硫酸，用棕色瓶保存)和B液(体积分数为0.2%的乙醛溶液)。将0.1 mL B液加入10 mL A液中，混匀。(2)条件：取一定量扩增前和扩增后的溶液分别放入等量的二苯胺试剂，混匀后观察颜色变化。用沸水浴加热上述溶液。(3)现象：出现蓝色现象。3.定量分析方法：如果需要进行定量分析，可以采用紫外分光光度法或琼脂糖凝胶电泳法。前者需要使用紫外分光光度计，后者需要使用电泳仪等。1.实验过程分析(1)离心的目的是什么？在离心的过程中，微量离心管的盖子为什么一定要盖严？答案离心的目的是使反应液集中在
12、离心管底部，提高反应效率。微量离心管的盖子一定要盖严，防止实验中脱落或液体外溢。(2)在离心前要用手轻轻弹击管的侧壁，目的是什么？答案离心前用手轻轻弹击管的侧壁目的是使反应液混合均匀。(3)PCR实验中使用的微量离心管、取液器、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌，为什么这样操作？还有哪些操作与此目的相同？答案为避免外源DNA等的污染。在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，取液器上的枪头都必须更换。2.结果检测(1)实验中为什么要测定DNA的含量？答案实际操作过程中会有许多因素影响DNA含量，所以需要对DNA含量进行测定。(2)如何判断DNA扩增成功？答案可以通过计算DNA
13、含量来评价扩增的效果。电泳检测的方法，可以通过在紫外线下直接观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。(3)PCR扩增过程可能会出现哪些异常结果？答案样品产物少，或产生新的DNA。3.进行PCR反应的具体实验操作顺序应为()设计好PCR仪的循环程序按配方准备好各组分用微量移液器向微量离心管中依次加入各组分进行PCR反应离心使反应液集中在离心管底部A. B.C. D.答案C 解析PCR反应的操作步骤一般分为准备(包括配制配方及将各配方放于实验台上)移液混合离心反应。PCR仪是一种自动控制温度的仪器，设计好循环程序就可以进行反应了。4.近20年来，PCR技术(多聚酶链式反应)成为分子生物学实验室的一种常规实验手段，其原理是利用DNA半保留复制，在试管中进行DNA的人工复制(如图)，在短时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，从而使实验室所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。(1)加热使DNA双链间的 键完全打开，称为 ；而在细胞中是在 酶的作用下进行的。(2)如果只需要大量克隆模板DNA中间的某个特定区段，应该加入 种特定的引物。当温度降低至55 时，引物与两条“舒展”的模板链的特定位置结合，在DNA聚合酶的作用下，只能在引物的 端连接脱氧核苷酸，两条子链的延伸方向都是 。(3)PCR技术的必需条件，除了模板、原料、酶之外，至少还有三个条件，即液体环境、适宜的 和 ，前者由
