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1、,第1课时 大肠杆菌的培养和分离,第一部分 微生物的利用,考试要求,一、微生物培养的基本条件,二、大肠杆菌的培养与分离操作,内容索引,当堂检测,一、微生物培养的基本条件,基础梳理,1.微生物基础知识 (1)微生物的特点： 简单，形体 。通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构。体内一般不含叶绿素，不能进行光合作用。,结构,微小,(2)细菌的外形与大小 外形分类,球,杆,弧,大小： 不分枝的 微生物，细胞微小而透明。通常用适当染料 后，再显微镜观察。 (3)细菌的繁殖：细菌以 的方式繁殖，分裂速度很快，约20分钟分裂一次。,单细胞,原核,染色,分裂,(4)菌落 概念： 或 细
2、菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有 的子细胞群体，叫做菌落。(如图) 作用：细菌的菌落特征因种而异，菌落是 的重要依据。,单个,少数,一定形态结构,鉴定菌种,2.培养基的种类 (1)按物理性质分类,固体,液体,(2)按培养基的用途分类,选择,鉴别,分离,鉴别,3.无菌技术 (1)含义：无菌技术不仅能防止实验室的培养物被其他外来微生物污染，保持微生物的纯培养，而且在分离、转接时亦能防止其他微生物污染。 (2)无菌操作 对实验空间、操作台可用 或酒精消毒，操作者的手用 消毒。 实验用的培养器皿和培养基一般用 法灭菌，接种环用灼烧方法灭菌。 为避免周围环境中微生物的污染，实验操
3、作应在 附近进行。 实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。,紫外线,酒精,高压蒸汽灭菌,酒精灯火焰,问题探究,1.结合所学知识，完成下图横线上大肠杆菌的结构名称，然后思考：,答案,核糖体,荚膜,细胞壁,质膜,拟核区(DNA),鞭毛,答案,(1)大肠杆菌与酵母菌相比，在结构上最主要的区别是什么？ 答案 大肠杆菌是原核生物，与酵母菌相比，最主要的区别是没有由核被膜包被的细胞核。 (2)大肠杆菌是革兰氏 性、 的肠道杆菌，在肠道中一般对人无害，但也有一些菌株对人体是有害的，可以侵袭 并产生毒素。但是，任何大肠杆菌如果进入人的 系统，都会对人体产生危害。 (3)应用：大肠杆菌是 技
4、术中被广泛采用的工具。,阴,兼性厌氧,肠黏膜,泌尿,基因工程,2.判断下面培养基的各种成分能提供的营养物质类别,答案,无机盐,碳源,氮源,生长因子,小贴士,(1)碳源的种类是判断微生物同化作用类型的依据，能利用无机碳源的生物是自养型的，只能利用有机碳源的生物是异养型的。含氮的有机物如蛋白质既可作为氮源，也可作为碳源。“细菌喜荤，霉菌喜素”，细菌培养基要用蛋白胨和酵母提取物来配制。霉菌培养基一般用无机物配制或添加蔗糖的豆芽汁。 (2)其他条件：在提供几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质及氧气的要求。例如：培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素；培养霉菌时需要将
5、培养基的pH调至中性偏酸；培养细菌时需要将pH调至中性或微碱性；培养厌氧型微生物时需要提供无氧的条件。,3.比较消毒和灭菌的不同之处,答案,较为温和,强烈,部分,全部,不能,能,小贴士,(1)每个细菌细胞仅形成一个芽孢，故它无繁殖功能。芽孢有极强的抗热、抗辐射、抗化学药物和抗静水压的能力。芽孢的休眠能力十分惊人，可保持几年到几十年的生活力。 (2)孢子是微生物产生的一种有繁殖或休眠作用的细胞。一般是单细胞，个体微小，通常是适应于从不利环境条件中存活下来，并在条件改变时产生新的营养体，能直接发育成新个体。,4.几种消毒和灭菌方法及其适用范围,答案,煮沸消毒,巴氏消毒,紫外线,答案,干热灭菌,高压
6、蒸汽灭菌,接种工具,试管口,耐高温,活学活用,1.下列关于大肠杆菌的表述，不正确的是 A.其细胞质中只有一种细胞器核糖体 B.在有氧条件下进行需氧呼吸，无氧条件下进行厌氧呼吸 C.除拟核外，在细胞质中还有许多小的环状DNA分子 D.常作为基因工程目的基因的受体菌,答案,2.连线无菌技术的方法、类型及对象,答案,二、大肠杆菌的培养与分离操作,基础梳理,1.培养基的配制 我们一般用LB液体培养基来扩大培养大肠杆菌，培养后再在LB固体培养基上划线进行分离。以下为本实验中培养基配制步骤，请完成： (1)称量： 。蛋白胨0.5 g，酵母提取物0.25 g，氯化钠0.5 g，加水50 mL。 (2)融化：
7、加热融化，用 定容到50 mL。配制LB固体培养基时还需加1 g ，整个过程不断用玻棒搅拌，目的是_ 。 (3)调pH：用1 mol/L NaOH溶液调节pH至 。,准确称取各成分,蒸馏水,琼脂,防止琼脂糊底而导致烧杯,破裂,偏碱性,(4)灭菌：在两个250 mL的三角瓶中分别装入50 mL LB液体培养基和50 mL LB固体培养基，加上棉塞。将培养皿用牛皮纸包好，放入_ 内，1 kg压力灭菌15 min。,灭菌,锅,(5)倒平板：灭菌后，待固体培养基冷却至 时在 附近进行操作。其过程(如下图)是：将灭过菌的培养皿放在 ，右手拿装有培养基的三角瓶，左手拔出棉塞；右手拿三角瓶，使三角瓶口_ ；
8、用左手将培养皿打开一条稍大于三角瓶口的缝隙，右手将培养基 ，立刻盖上皿盖；待平板冷却凝固后，将_ 。,60 左右,酒精灯火焰,火焰旁,迅速,通过火焰,倒入培养皿,平板倒过来,放置,2.细菌的分离方法 (1)划线分离法：在液体培养基中，只要接种后培养 h，每毫升培养基中就有几亿个细菌。可用 蘸取菌液在固体培养基上划线，在划线过程中接种环上的菌液逐渐 ，因此，划线最后部分的细菌间的_ 加大。将接种后的固体培养基培养1020 h后，可由 产生 。如果再将每个菌落分别接种至含有固体培养基的试管斜面上，在斜面上 ，则每个斜面的菌群就是由一个细菌产生的后代。这种方法也可用于_ ，将污染的 除去。,8,接种
9、环,减少,距离,一个细菌,单菌落,划线,分离,细菌,杂菌,(2)涂布分离法：先将培养的菌液 ，通常稀释 倍，然后取 mL稀释度不同的稀释液，加在培养皿的固体培养基上，用_ 涂布在培养基平面上，然后进行培养。在 的稀释度下，可培养得到相互分开的菌落。通常以每个培养皿中有 个以内的单菌落最为适合。 (3)两种分离法的比较： 分离法，方法简单； 分离法，单菌落更易分开，但操作复杂些。,105107,0.1,玻璃刮刀,适当,20,划线,涂布,稀释,3.大肠杆菌的培养和分离 (1)实验内容：将大肠杆菌扩大培养和划线分离，即用 培养基扩大培养大肠杆菌，培养后再在 培养基上划线进行分离，随后培养基上就会形成
10、一个个单独的菌落。 (2)实验步骤,高压,LB液体,LB固体平面,蒸汽,倒平板,_, 划线分离 培养观察,三角瓶,连续划线,单个菌落,接种,问题探究,1.固体培养基经高压蒸汽灭菌后，待培养基冷却到60 时，需搁置斜面(图甲)或倒平板(图乙)，请回答：,答案,(1)如何确定制备的培养基灭菌是否合格？ 答案 将未接种的培养基在适宜的温度下放置一定时间，观察培养基上是否有菌产生。,(2)在固体培养基凝固前搁置斜面的目的是什么？ 答案 增大接种面积。 (3)平板冷凝后，为什么要将平板倒置？ 答案 平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地
11、挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。,答案,2.某同学在纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成了一片，最可能的原因是什么？应当怎样操作才可避免此种现象？ 答案 最可能的原因是菌液浓度过高或划线时在划下一区域前未将接种环灼烧灭菌；采取的措施是增大稀释倍数或每次划新区域前先将接种环灼烧灭菌。,答案,活学活用,3.以下接种、分离操作中，正确的是 A.接种前，在火焰上烧红了的接种环，应先冷却再取菌体 B.划线分离时，应间断式划线 C.接种环可在菌液中多次蘸液 D.菌体放入三角瓶的液体培养基中后，三角瓶的封口膜需重新制作,答案,解析,解析 划线分离时的划线一定要是连续的；接种时，接种环
12、只能在菌液中蘸取一次，否则会污染菌液；三角瓶的封口膜不需要重新制作，用刚取下的即可。,4.请结合图示，回答下列有关大肠杆菌分离与纯化的问题：,(1)稀释 用1 mL无菌吸管吸取1 mL大肠杆菌培养液，加入到盛有9 mL 的大试管中，充分混匀，稀释 倍；按照同样的方法依次进行稀释制成101、102、103、104、105、106系列稀释度的大肠杆菌稀释液。,答案,无菌水,10,(2)划线或涂布 划线分离法 a.操作：在 旁，左手拿培养皿，右手拿接种环，挑取大肠杆菌培养液在平板上划线。 b.划线方法： 划线和 划线。,答案,酒精灯火焰,平行,连续,c.平行划线时，第一次划线及每次划线之间都要灼烧接
13、种环，划线结束后也要灼烧接种环，目的分别是什么？,答案 如表所示,答案,涂布分离法 a.将 浸在盛有酒精的烧杯中。 b.取不超过0.1 mL的 ，滴加到培养基表面。 c.将蘸有少量酒精的玻璃刮刀在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却810 s。 d.用玻璃刮刀将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使菌液分布均匀。,答案,玻璃刮刀,菌液,答案,(3)培养：将接种的平板 于培养箱或温室中37 培养1224 h。,倒置,判断正误： (1)大肠杆菌是革兰氏阴性菌，对人无害( ) (2)扩大培养大肠杆菌常用LB液体培养基( ) (3)利用涂布分离法分离细菌时，需要先将培养的菌液进行梯度稀释( )
14、(4)在“大肠杆菌的培养和分离”实验中所用棉花为脱脂棉( ),答案,答案,(5)下图中甲为划线分离法中最重要的环节，乙为操作的结果 每一次划线后都要将接种环灼烧( ) 除第一次划线外，每一次划线的起点都是第一次划线的末端( ),课堂小结,划线分离,涂布分离,灭菌,当堂检测,1.划线分离法和涂布分离法是接种微生物的两种常用方法，下列描述正确的是 A.都要将菌液进行一系列的梯度稀释 B.划线分离法是将不同稀释度的菌液通过接种环在固体培养基表面连 续划线的操作 C.涂布分离法是将不同稀释度的菌液倒入液体培养基进行培养 D.都能在培养基表面形成单个菌落,2,3,4,5,1,答案,解析,解析 划线分离法
15、不需要进行梯度稀释； 划线分离法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面； 涂布分离法需要将不同稀释度的菌液涂布到琼脂固体培养基的表面； 划线分离法和涂布分离法都能在培养基表面形成单个菌落。,2,3,4,5,1,2.下图为实验室培养和纯化大肠杆菌过程中的部分操作步骤，下列说法错误的是 A.步骤操作时需要在酒精灯火焰旁进行 B.步骤中，待倒入的培养基冷却后盖上培养皿的皿盖 C.步骤中，每次划线前都需对接种环进行灼烧处理 D.划线接种结束后，将图平板倒置后放入培养箱中培养,答案,解析,2,3,4,1,5,2,3,4,1,5,解析 由图可知，步骤是倒平板，步骤是用接种环蘸取菌液，步骤是进行平板划线
