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1、我带领班子成员及全体职工，积极参加县委、政府和农牧局组织的政治理论学习，同时认真学习业务知识，全面提高了自身素质，增强职工工作积极性，杜绝了纪律松散第1课时大肠杆菌的培养和分离考试要求知识内容考试属性及要求考情解读大肠杆菌的培养和分离加试1.进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作。2.进行大肠杆菌的分离，用固体平面培养基进行细菌的画线培养。3.说明大肠杆菌培养的条件和实验原理。一、微生物培养的基本条件1.微生物基础知识(1)微生物的特点：结构简单，形体微小。通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构。体内一般不含叶绿素，不能进行光合作用。(2)细菌的外形与大小外
2、形分类大小：单细胞不分枝的原核微生物，细胞微小而透明。通常用适当染料染色后，再显微镜观察。(3)细菌的繁殖：细菌以分裂的方式繁殖，分裂速度很快，约20分钟分裂一次。(4)菌落概念：单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。(如图)作用：细菌的菌落特征因种而异，菌落是鉴定菌种的重要依据。2.培养基的种类(1)按物理性质分类种类是否含凝固剂用途固体培养基是主要用于微生物的分离与鉴定等液体培养基否主要用于扩大培养或工业生产(2)按培养基的用途分类种类制备方法用途选择培养基加入某种化学物质从众多的微生物中分离所需微生物鉴别培养基加入某种试剂
3、鉴别不同种类的微生物3.无菌技术(1)含义：无菌技术不仅能防止实验室的培养物被其他外来微生物污染，保持微生物的纯培养，而且在分离、转接时亦能防止其他微生物污染。(2)无菌操作对实验空间、操作台可用紫外线或酒精消毒，操作者的手用酒精消毒。实验用的培养器皿和培养基一般用高压蒸汽灭菌法灭菌，接种环用灼烧方法灭菌。为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。1.结合所学知识，完成下图横线上大肠杆菌的结构名称，然后思考：(1)大肠杆菌与酵母菌相比，在结构上最主要的区别是什么？答案大肠杆菌是原核生物，与酵母菌相比，最主要的区别是没
4、有由核被膜包被的细胞核。(2)大肠杆菌是革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌，在肠道中一般对人无害，但也有一些菌株对人体是有害的，可以侵袭肠黏膜并产生毒素。但是，任何大肠杆菌如果进入人的泌尿系统，都会对人体产生危害。(3)应用：大肠杆菌是基因工程技术中被广泛采用的工具。2.判断下面培养基的各种成分能提供的营养物质类别成分FeSO4蔗糖(NH4)2SO4维生素提供的营养无机盐碳源氮源生长因子小贴士(1)碳源的种类是判断微生物同化作用类型的依据，能利用无机碳源的生物是自养型的，只能利用有机碳源的生物是异养型的。含氮的有机物如蛋白质既可作为氮源，也可作为碳源。“细菌喜荤，霉菌喜素”，细菌培养基要用蛋白胨和
5、酵母提取物来配制。霉菌培养基一般用无机物配制或添加蔗糖的豆芽汁。(2)其他条件：在提供几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质及氧气的要求。例如：培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素；培养霉菌时需要将培养基的pH调至中性偏酸；培养细菌时需要将pH调至中性或微碱性；培养厌氧型微生物时需要提供无氧的条件。3.比较消毒和灭菌的不同之处比较项目理化因素的作用强度消灭微生物的数量芽孢和孢子能否被消灭消毒较为温和部分对人体有害的生活状态的微生物不能灭菌强烈全部微生物能小贴士(1)每个细菌细胞仅形成一个芽孢，故它无繁殖功能。芽孢有极强的抗热、抗辐射、抗化学药物和抗静水压的能
6、力。芽孢的休眠能力十分惊人，可保持几年到几十年的生活力。(2)孢子是微生物产生的一种有繁殖或休眠作用的细胞。一般是单细胞，个体微小，通常是适应于从不利环境条件中存活下来，并在条件改变时产生新的营养体，能直接发育成新个体。4.几种消毒和灭菌方法及其适用范围类型适用范围操作方法消毒方法煮沸消毒法日常生活100 煮沸56 min巴氏消毒法不耐高温的液体7075 煮30 min或80 煮15 min化学药剂生物活体、水源等擦拭等，如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源紫外线房间、仪器设备紫外线照射30 min灭菌方法灼烧接种工具、接种时用的试管口或瓶口等直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧干热灭菌耐高温、需要保
7、持干燥的物品，如玻璃器皿和金属用具等物品放入干热灭菌箱，160170 加热12 h高压蒸汽灭菌培养基、培养皿等，生产和实验室常用高压蒸汽灭菌锅内，100 kPa，温度121 ，1530 min过滤不耐高温的物质，如尿素、酶等G6玻璃砂漏斗过滤1.下列关于大肠杆菌的表述，不正确的是()A.其细胞质中只有一种细胞器核糖体B.在有氧条件下进行需氧呼吸，无氧条件下进行厌氧呼吸C.除拟核外，在细胞质中还有许多小的环状DNA分子D.常作为基因工程目的基因的受体菌答案D2.连线无菌技术的方法、类型及对象二、大肠杆菌的培养与分离操作1.培养基的配制我们一般用LB液体培养基来扩大培养大肠杆菌，培养后再在LB固体
8、培养基上划线进行分离。以下为本实验中培养基配制步骤，请完成：(1)称量：准确称取各成分。蛋白胨0.5 g，酵母提取物0.25 g，氯化钠0.5 g，加水50 mL。(2)融化：加热融化，用蒸馏水定容到 50 mL。配制LB固体培养基时还需加1 g琼脂，整个过程不断用玻棒搅拌，目的是防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。(3)调pH：用1 mol/L NaOH溶液调节pH至偏碱性。(4)灭菌：在两个250 mL的三角瓶中分别装入50 mL LB液体培养基和50 mL LB固体培养基，加上棉塞。将培养皿用牛皮纸包好，放入灭菌锅内，1 kg压力灭菌15 min。(5)倒平板：灭菌后，待固体培养基冷却至60 左
9、右时在酒精灯火焰附近进行操作。其过程(如下图)是：将灭过菌的培养皿放在火焰旁，右手拿装有培养基的三角瓶，左手拔出棉塞；右手拿三角瓶，使三角瓶口迅速通过火焰；用左手将培养皿打开一条稍大于三角瓶口的缝隙，右手将培养基倒入培养皿，立刻盖上皿盖；待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置。2.细菌的分离方法(1)划线分离法：在液体培养基中，只要接种后培养8h，每毫升培养基中就有几亿个细菌。可用接种环蘸取菌液在固体培养基上划线，在划线过程中接种环上的菌液逐渐减少，因此，划线最后部分的细菌间的距离加大。将接种后的固体培养基培养1020 h后，可由一个细菌产生单菌落。如果再将每个菌落分别接种至含有固体培养基的试管斜
10、面上，在斜面上划线，则每个斜面的菌群就是由一个细菌产生的后代。这种方法也可用于分离细菌，将污染的杂菌除去。(2)涂布分离法：先将培养的菌液稀释，通常稀释105107倍，然后取0.1 mL稀释度不同的稀释液，加在培养皿的固体培养基上，用玻璃刮刀涂布在培养基平面上，然后进行培养。在适当的稀释度下，可培养得到相互分开的菌落。通常以每个培养皿中有20个以内的单菌落最为适合。(3)两种分离法的比较：划线分离法，方法简单；涂布分离法，单菌落更易分开，但操作复杂些。3.大肠杆菌的培养和分离(1)实验内容：将大肠杆菌扩大培养和划线分离，即用LB液体培养基扩大培养大肠杆菌，培养后再在LB固体平面培养基上划线进行
11、分离，随后培养基上就会形成一个个单独的菌落。(2)实验步骤培养基灭菌倒平板接种划线分离培养观察50 mL LB液体培养基和50 mL LB固体培养基及培养皿高压蒸汽灭菌将培养基分别倒入4个灭菌后的培养皿中，水平放置，使之形成平面在装有液体培养基的三角瓶中接种大肠杆菌，培养12 h用接种环在接种有大肠杆菌的三角瓶中蘸菌液一次，在固体培养基的平板上连续划线，盖好培养皿培养皿倒置(盖在下面)，放在37 恒温培养箱中培养1224 h后，可看到划线的末端出现不连续的单个菌落1.固体培养基经高压蒸汽灭菌后，待培养基冷却到60 时，需搁置斜面(图甲)或倒平板(图乙)，请回答：(1)如何确定制备的培养基灭菌是
12、否合格？答案将未接种的培养基在适宜的温度下放置一定时间，观察培养基上是否有菌产生。(2)在固体培养基凝固前搁置斜面的目的是什么？答案增大接种面积。(3)平板冷凝后，为什么要将平板倒置？答案平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。2.某同学在纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成了一片，最可能的原因是什么？应当怎样操作才可避免此种现象？答案最可能的原因是菌液浓度过高或划线时在划下一区域前未将接种环灼烧灭菌；采取的措施是增大稀释倍数或每次划新区域前先将接种环灼烧灭菌。3.以下接种
13、、分离操作中，正确的是()A.接种前，在火焰上烧红了的接种环，应先冷却再取菌体B.划线分离时，应间断式划线C.接种环可在菌液中多次蘸液D.菌体放入三角瓶的液体培养基中后，三角瓶的封口膜需重新制作答案A解析划线分离时的划线一定要是连续的；接种时，接种环只能在菌液中蘸取一次，否则会污染菌液；三角瓶的封口膜不需要重新制作，用刚取下的即可。4.请结合图示，回答下列有关大肠杆菌分离与纯化的问题：(1)稀释用1 mL无菌吸管吸取1 mL大肠杆菌培养液，加入到盛有9 mL 的大试管中，充分混匀，稀释 倍；按照同样的方法依次进行稀释制成101、102、103、104、105、106系列稀释度的大肠杆菌稀释液。
14、(2)划线或涂布划线分离法a.操作：在 旁，左手拿培养皿，右手拿接种环，挑取大肠杆菌培养液在平板上划线。b.划线方法： 划线和 划线。c.平行划线时，第一次划线及每次划线之间都要灼烧接种环，划线结束后也要灼烧接种环，目的分别是什么？涂布分离法a.将 浸在盛有酒精的烧杯中。b.取不超过0.1 mL的 ，滴加到培养基表面。c.将蘸有少量酒精的玻璃刮刀在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却810 s。d.用玻璃刮刀将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使菌液分布均匀。(3)培养：将接种的平板 于培养箱或温室中37 培养1224 h。答案(1)无菌水10(2)a.酒精灯火焰b.平行连续c.如表所示第一次灼烧每次划线之前灼烧划线结束时灼烧目的杀死接种环上原有的微生物杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端，使每次划线后菌种数目减少杀死接种环上残存的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者a.玻璃刮刀b.菌液(3)倒置一题多变判断正误：(1)大肠杆菌是革兰氏阴性菌，对人无害()(2)扩大培养大肠杆菌常用LB液体培养基()(3)利用涂布分离法分离细菌时，需要先将培养的菌液进行梯度稀释()(4)在“大
