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1、我带领班子成员及全体职工，积极参加县委、政府和农牧局组织的政治理论学习，同时认真学习业务知识，全面提高了自身素质，增强职工工作积极性，杜绝了纪律松散第2课时分离特定的微生物并测定其数量学习导航1.认识各种微生物形成的菌落特征。2.学会利用涂布平板法分离、培养微生物，并能测定其数量。3.掌握利用选择培养基分离特定微生物的方法。重难点击简述分离、培养微生物的方法及数量测定。一、微生物分离和培养的基本理论1.纯培养物培养在实验室中利用选择培养基可以筛选和分离某种微生物，然后在高度稀释的条件下，在固体培养基上培养该微生物形成单个菌落，即由一个微生物(如某种细菌)形成的单个菌落。单个菌落即为纯培养物，可
2、用于科学研究。2.分离特定的微生物(1)平板分离法概念：能将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面，每个孤立的活微生物体经过生长、繁殖均可形成单个菌落。分离、培养微生物最常用的培养基是琼脂固体培养基。类型：平板分离法有多种，如涂布平板法、混合平板法等。a.涂布平板法分离细菌：将待分离的样品进行10倍系列稀释，取一定稀释度的样品0.1 mL倒入预先制备好的培养基平板中，用无菌玻璃涂布器将样品涂布均匀，恒温培养一段时间，以获得单个菌落的方法。b.混合平板法分离细菌：将待分离的样品进行10倍系列稀释，取一定稀释度的样品0.1 mL与熔化冷却至50_左右的培养基混合均匀，将混合液倒入无菌培养皿中制
3、成平板，培养一段时间，以获得单个菌落的方法。(2)选择培养分离概念：科学家针对某种微生物的特性，设计一个特定的环境，使之特别适合这种微生物的生长，而抑制其他微生物的生长。这种通过选择培养进行微生物纯培养分离的技术称为选择培养分离。依据原理：不同的微生物有不同的营养需求或对某种化学物质有不同的敏感性。举例a.要分离耐高温菌，可在高温条件下进行培养。b.要分离对某种抗生素具有抗性的菌种，可在加有该抗生素(如链霉素或青霉素)的平板上进行分离。c.在培养基中加入质量分数为10%的酚，可以抑制细菌和霉菌的生长。d.运用将纤维素作为唯一碳源和能源的培养基，可以有效地分离能分解纤维素的细菌。e.运用无氮培养
4、基(培养基完全不含氮元素)，可选择能固氮的细菌。f.运用只含尿素而不含其他氮元素的培养基，可以选择能分解尿素以获取氮的微生物(能合成脲酶的微生物可以分解尿素)。3.观察各种微生物形成的菌落(1)菌落：指单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度，形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。(2)菌落特征：不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落一般都具有稳定的特征，如菌落的大小、形状、边缘特征、隆起程度、颜色等，这些可以作为对微生物进行分类、鉴定的重要依据。1.如何从众多微生物中分离某种微生物，所利用的原理是什么？答案根据微生物所需营养物质、氧气、pH不同利用选择培养基选择。
5、2.结合教材完善下图中两种分离和纯化微生物的平板分离法并思考：(1)涂布平板法的实质是什么？答案在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个菌落。(2)试比较两种分离和纯化方法项目操作特点结果涂布平板法取一定稀释度的样品涂布平板用无菌玻璃涂布器将样品涂布均匀先制作平板后加入菌液细菌菌落通常仅在平板表面生长混合平板法取一定稀释度的样品与熔化的培养基混合将与样品混合后的培养基倒入无菌培养皿菌液与培养基混合，共同倒平板细菌菌落出现在平板表面和内部3.选择培养分离所利用的培养基是什么培养基？它利用的原理是什么？答案选择培养分离所利用的培养基是选择培养基。它利
6、用的原理是不同的微生物有不同的营养需求或对某种化学物质有不同的敏感性。4.通常以菌落的哪些表观特征来对微生物进行分类、鉴定等？答案菌落的大小、形状、边缘特征、隆起程度、颜色等。归纳总结(1)菌落的特征：菌落形态包括菌落的大小、形状、边缘、光泽、质地、颜色和透明程度等。每一种细菌在一定条件下形成固定的菌落特征。这些特征对菌种识别、鉴定有一定意义。(2)选择培养基筛选微生物的方法在培养基中加入某种化学物质。改变培养基中的营养成分。改变微生物的培养条件。(3)平板划线法和涂布平板法的比较项目优点缺点平板划线法可以观察菌落特征，对混合菌进行分离不能计数涂布平板法可以计数，可以观察菌落特征吸收量较少，较
7、麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延1.下列有关涂布平板法，叙述错误的是()A.首先将菌液进行一系列的梯度稀释B.然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面C.在适宜条件下培养D.结果都可在培养基表面形成单个的菌落答案D解析涂布平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。用不同稀释度的菌液接种，只有在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物被分散成单个细胞，才能够在培养基表面形成单个菌落，而不是所有培养基上均可出现单个菌落。一题多变(1)移液时需要注意哪些问题？答案移液管也需经过灭菌。操作时，试管口和移液管应在离火焰12 cm处，
8、吸管头不要接触任何其他物体。(2)如何处理涂布器？答案将涂布器浸在盛有70%酒精的烧杯中，取出时，让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃。2.从自然菌样中筛选较理想生产菌种的一般步骤是：采集菌样富集培养纯种分离性能测定。(1)不同微生物的生存环境不同，获得理想微生物的第一步是从适合的环境采集菌样，然后再按一定的方法分离、纯化。培养嗜盐菌的菌样应从_(填“高盐”或“低盐”)环境采集，培养厌氧菌的菌样应从_(填“有氧”或“无氧”)环境采集。(2)富集培养指创设仅适应于该条件的微生物旺盛生长的特定的环境条件，使待分离微生物在群落中的数量大大增加，从而达到从自然界中分离到所需
9、的特定微生物目的的微生物培养方法。对嗜盐菌富集培养的培养基应是_培养基；对含耐高温淀粉酶的微生物富集培养应选择_的培养基，并在_条件下培养。(3)实验室最常用的灭菌方法是利用高温处理达到杀菌的效果。高温灭菌的原理是高温使微生物的蛋白质和核酸等物质发生_。_灭菌法是微生物研究和教学中应用最广、效果最好的湿热灭菌法。(4)如图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图解，请分析接种的具体方法。获得图A效果的接种方法是_；获得图B效果的接种方法是_。答案(1)高盐无氧(2)加盐以淀粉为唯一碳源高温(3)变性高压蒸汽(4)涂布平板法平板划线法解析(1)在长期自然选择的作用下，生物与其生活环境
10、相适应，培养嗜盐菌的菌样应从高盐环境中采集，培养厌氧菌应从无氧环境中采集。(2)对嗜盐菌富集培养的培养基应是加盐培养基，对含耐高温淀粉酶的微生物富集培养应选择以淀粉为唯一碳源的培养基且在高温条件下培养。(3)高温能使蛋白质和核酸发生不可逆转的变性，高压蒸汽灭菌法是应用最广、效果最好的湿热灭菌法。(4)从培养基中菌落分布看，获得图A用的是涂布平板法，获得图B用的是平板划线法。二、以尿素为唯一氮源的土壤微生物的分离、培养与数量测定1.原理：采用唯一氮源为尿素的选择培养基来培养。分离出能在此培养基中生长、繁殖的微生物。2.实验流程采集土壤，制备悬液：制备系列稀释液选择培养：采用选择培养基培养接种：涂
11、布平板培养与观察计数菌落：选取菌落数为30300的一组为样本进行统计3.显微镜直接计数法(1)原理此法利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物数量，但不能区分细菌的死活。血球计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定的容积为110.1mm3的计数室。计数室的规格有两种，分别是2516个小方格或1625个小方格。但两种规格的计数室都是由400个小格组成的。具体如下图：(2)操作将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，用无菌的毛细滴管吸取摇匀的土壤微生物培养液，在盖玻片的边缘滴一小滴，让培养液沿着缝隙通过毛细渗透作用自动进入计数室。加样后静置5 min，然后将血球计数板置于显微镜载物台上，先用
12、低倍镜找到计数室所在位置，再换成高倍镜进行观察和计数。(3)计数若规格为1625型的血球计数板，则在计数室内选4个中方格(如图中加黑点的左上、右上、左下、右下四个角)中的菌体进行计数。若使用规格为2516型的血球计数板，则在计数室内选5个中方格(四个角和中央的方格)中的菌体进行计数。对位于格线上的菌体，一般只统计上方和右边格线上的。求出每个小格所含细菌的平均数，再按下面公式求出每毫升样品中所含的细菌数。计算公式如下：每mL原液所含细菌数每小格平均细菌数400104稀释倍数。(4)使用完毕后，将血球计数板用水反复冲洗干净，切勿用硬物洗刷。洗完后自然晾干即可。1.筛选分解尿素的细菌的选择培养基下面
13、是筛选分解尿素的细菌使用的培养基的配方，请分析：KH2PO41.4 gNa2HPO42.1 gMgSO47H2O0.2 g葡萄糖10.0 g尿素1.0 g琼脂15.0 g将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL(1)在培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？答案碳源是葡萄糖，氮源是尿素。(2)分离分解尿素的细菌的选择培养基是如何进行选择的？答案该选择培养基的配方中，尿素是培养基中的唯一氮源，因此，只有能够利用尿素的微生物才能够生长。(3)为什么只有能分解尿素的微生物才能在该培养基上生长？答案分解尿素的微生物能合成脲酶，而脲酶可将尿素分解成氨，从而为微生物生长提供氮
14、源。2.下面是土壤中尿素分解菌的分离与计数的实验流程示意图，请结合教材提供的资料分析回答下列问题：(1)试写出分离土壤中分解尿素的细菌的实验流程。答案土壤取样样品稀释取样涂布微生物培养观察并记录结果细菌计数。(2)统计菌落数目甲、乙两位同学用涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230，该同学的统计结果是否真实可靠？为什么？答案不真实。为增加实验的说服力与准确性，应设置重复实验，在同一稀释度下涂布3个平板，统计结果后计算平均值。乙同学在该浓度下涂布了3个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学将21舍去，然后取平均值。该同学对实验结果的处理是否合理？为什么？答案不合理。微生物计数时，如果实验中出现重复实验的结果不一致的情况，应分析实验过程中可能的影响因素，找出差异的原因，而不能简单地舍弃后进行计数。某同学在三种稀释度下吸取0.1 mL的菌液涂布平板，统计菌落数，得到以下的数据，试计算1 g样品的活菌数。平板稀释度 平板1平板2平板310432036035610521223428710621
