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1、我带领班子成员及全体职工，积极参加县委、政府和农牧局组织的政治理论学习，同时认真学习业务知识，全面提高了自身素质，增强职工工作积极性，杜绝了纪律松散第2课时获取目的基因、构建基因表达载体学习导航1.概述获取目的基因的方法，特别说明PCR的原理。2.结合图110，说出基因表达载体的构建。重难点击获取目的基因的途径及基因表达载体的构建。方式一抑制疾病传播的转基因蚊子巴西等拉美国家深受致倦库蚊的危害。致倦库蚊可携带多种病毒和寄生虫，能够传播脑炎、丝虫等传染病，而这些传染病常年在拉美国家肆虐。为了抑制疾病的传播，巴西科学家培育出了一种转基因雄性致倦库蚊。科学家在雄性致倦库蚊体内植入一种特殊基因，当具该
2、基因的转基因雄蚊与野生雌蚊交配时，这种基因可以进入雌蚊的基因组，并使雌蚊死亡，从而减少了该种蚊子的数量，达到抑制疾病传播的目的。怎样才能最终得到转基因雄蚊呢？让我们一起来学习基因工程的基本操作程序吧！方式二师：出示我国有知识产权的转基因抗虫棉的培育图解：问：转基因抗虫棉的培育需要哪些步骤？学生看图并回答：首先要获得目的基因，其次将目的基因连接到Ti质粒上，然后将重组的Ti质粒导入受体细胞，最后要重建转基因植物。根据学生回答补充：还需检测抗虫基因是否已经进入棉花植株，并由此引出基因工程的四部曲。一、获取目的基因1通过基因文库获取目的基因(1)概念先用酶切等方法将某种生物细胞的整个基因组DNA切割
3、成大小合适的片段，再将这些片段分别和载体连接起来，导入受体菌的群体并储存起来，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，这个群体称为基因文库。(2)种类2通过PCR技术扩增目的基因(1)原理：DNA分子半保留复制。(2)基本过程加入反应物质：在离心管中加入所需要的模板DNA、引物、4种脱氧核苷酸以及TaqDNA聚合酶。变性：加热至94 左右，使DNA中的氢键断裂，双链解开。退火(复性)：冷却到55 左右，引物与单链DNA相应互补序列结合。延伸：加热至72 左右，在TaqDNA聚合酶的作用下，沿模板延伸子链，最终合成2条DNA分子。(3)若PCR过程中，扩增循环的次数是n，则目的基因的量将被扩增2n
4、倍。(4)PCR技术中因为需要在高温下进行，因此TaqDNA聚合酶需要有什么特性？答案具有热稳定性。3通过化学方法直接人工合成目的基因如果目的基因较小，脱氧核苷酸序列又已知，可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。1从基因文库中获取目的基因(1)cDNA文库是从某种生物的某一细胞中提取出mRNA，经逆转录过程获得的基因文库，为什么该基因文库仅含有该生物的部分基因？答案由于基因的选择性表达，某种生物的某一细胞中仅有部分基因转录出mRNA，所以由该细胞中的mRNA逆转录得到的基因文库仅含该生物的部分基因。(2)结合概念，从范围上比较基因组文库和cDNA文库(部分基因文库)之间的大小关系：基因组
5、文库cDNA文库。(3)基因文库的组建过程所包含基因工程的步骤目的基因的获取：将某种生物体内的DNA全部提取出来，选用适当的限制酶，将DNA切成一定范围大小的DNA片段。重组质粒的构建：将所获得的DNA片段分别与载体连接起来。目的基因导入受体细胞：将重组质粒导入受体菌的群体中储存。2PCR技术与DNA复制的比较比较项目DNA复制PCR技术区别解旋方式解旋酶催化DNA在高温下变性解旋场所细胞内(主要在细胞核内)细胞外(主要在PCR扩增仪中)酶解旋酶、DNA聚合酶热稳定的DNA聚合酶温度细胞内温和条件控制温度，需在较高温度下进行结果合成DNA分子合成DNA片段或基因联系(1)模板：均需要脱氧核苷酸
6、双链作为模板(2)原料：均为四种脱氧核苷酸(3)酶：均需DNA聚合酶(4)引物：都需要引物，使DNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成归纳总结两种人工合成目的基因的方法比较(1)逆转录法主要用于相对分子质量较大而又不知其序列的基因，它是以目的基因的mRNA为模板，借助逆转录酶合成碱基互补的单链DNA，然后在DNA聚合酶的作用下合成双链DNA。其过程如下图：(2)化学合成法即依照某一蛋白质的氨基酸序列，通过密码子推算出其基因序列，然后直接合成目的基因。其过程如下图：由于真核细胞的基因含有不表达的DNA片段，不能直接用于基因的扩增和表达，因此，在获取真核细胞中的目的基因时，一般是用人工合成目的基因的
7、方法。1为从根本上解决水稻中的高植酸问题，可将植酸酶基因导入水稻，培育低植酸转基因水稻品种。下图是获取植酸酶基因的流程。据图回答下列问题：(1)B过程需要的酶是_。(2)图中基因组文库_(填“小于”“大于”或“等于”)cDNA文库。(3)目的基因和除可从构建的文库中分离外，还可以分别利用图中_和_为模板直接进行PCR扩增，该过程中所用酶的显著特点是_。答案(1)逆转录酶(2)大于(3)DNAcDNA耐高温解析B过程是以RNA为模板合成DNA的逆转录过程，需要的酶是逆转录酶；目的基因和除可从构建的文库中分离外，还可以分别利用图中DNA和cDNA为模板直接进行PCR扩增，该过程中所用酶的显著特点是
8、耐高温。一题多变判断正误：(1)直接分离目的基因的方法其优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性()(2)由于真核细胞的基因含有不表达的DNA片段，一般使用人工合成的方法()(3)目前人工合成目的基因的方法主要有两种，分别是逆转录法和化学合成法()(4)PCR技术的原理是DNA复制，需要RNA聚合酶催化DNA合成()答案(1)(2)(3)(4)解析PCR技术扩增的原理是DNA半保留复制，需要耐高温的DNA聚合酶催化，并以脱氧核苷酸为原料。易错辨析认清基因组文库法与逆转录法获取目的基因的不同(1)酶：前者需要限制酶；后者需要逆转录酶。(2)原料：前者不需要原料；后者需要脱氧核苷酸。(3)
9、结构：前者基因中含有启动子，能转录；后者基因中没有启动子，只将编码序列导入受体细胞，故无法进行转录。2以下为形成cDNA(图中的单链DNA)过程和PCR扩增过程示意图。据图分析，下列说法正确的是()A催化过程的酶是RNA聚合酶B过程发生的变化是引物与单链DNA结合C催化过程的酶都是DNA聚合酶，都能耐高温D如果RNA单链中A与U之和占该链碱基含量的40%，则一个双链DNA中，A与U之和也占该DNA碱基含量的40%答案B解析由题意可知，分别表示逆转录、DNA的复制、DNA解链、引物结合到互补DNA单链及互补链的合成，B正确；过程由逆转录酶催化完成，A错；催化过程的酶都是DNA聚合酶，过程是在72
10、 的高温条件下进行的，只有该过程中的酶需耐高温，C错；在DNA分子中有T无U，D错。3如图表示基因工程中获取水稻某目的基因的不同方法。下列相关叙述中正确的是()A三种方法都需要酶并均在体外进行B碱基对的排列顺序均相同C三种方法均属于人工合成法D方法a不遵循中心法则答案A解析这三种方法都是在体外进行的，且都用到酶(方法a需要逆转录酶和DNA聚合酶；方法b需要限制酶；方法c需要DNA聚合酶)，A正确；通过方法a得到的目的基因不含有内含子，通过方法c得到的目的基因的碱基序列可能有多种，因此碱基对的排列顺序不都相同，B错误；图示a和c属于人工合成法，而b是从供体细胞的DNA中直接分离目的基因的方法，C
11、错误；方法a遵循中心法则，D错误。二、构建基因表达载体基因表达载体的构建(如图)(1)启动子：位于目的基因上游的一段核苷酸序列，是RNA聚合酶识别、结合的部位，能驱动基因转录合成相应的mRNA。(2)终止子：是一段特殊的DNA片段，是载体上终止目的基因转录的核苷酸序列。(3)标记基因：是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因。常用的标记基因主要是抗性基因、某些生化表型基因。(4)目的基因：目的基因插在启动子和终止子之间。结合基因表达载体模式图分析以下问题：1用字母和文字表示基因表达载体的组成。答案基因表达载体的组成：a启动子b终止子c标记基因d复制原点e目的基因。2启动子和终止子与起始密码子和终止
12、密码子是一回事吗？答案不是一回事，启动子和终止子位于DNA上，是基因表达载体必需的部分。而起始密码子和终止密码子位于mRNA上，决定翻译的开始和结束。3为什么目的基因要插入启动子和终止子之间？答案启动子使转录开始，是RNA聚合酶识别和结合的部位；终止子位于基因的尾端，使转录终止；只有顺序正确，目的基因才能正常转录。4下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请据图回答下列问题：限制酶BamHHindEcoRSma识别序列及切割位点(1)结合下图重组质粒的构建过程分析：图中为同一种限制酶，为DNA连接酶。(2)构建基因表达载体时，能否用Sma酶切割质粒
13、？为什么？答案不能。因为Sma会破坏质粒的抗性基因。质粒上的抗性基因是标记基因。标记基因用于鉴定受体细胞是否成功导入目的基因，以便将含目的基因的细胞筛选出来，若被破坏，无法进一步筛选。(3)与只使用EcoR相比较，使用BamH和Hind两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点是什么？答案可以防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化。总结提升(1)选用同一种限制酶切割目的基因和载体的原因：选用同一种限制酶切割会产生相同的黏性末端，可以在DNA连接酶的作用下将切割的目的基因和载体连接起来。(2)基因工程操作时往往用两种限制酶分别切割目的基因的两端以及载体的原因：如果用一种限制酶切割，目的基因两
14、侧的末端以及质粒切口的两个末端都是互补的，因此连接时可能会出现载体与载体、目的基因与目的基因、目的基因与载体三种连接情况，而符合要求的只有载体与目的基因的连接。如果用两种不同的限制酶进行切割就可以有效避免载体与载体以及目的基因与目的基因的连接，提高连接的有效性。4下图为基因表达载体的模式图，下列有关基因工程中载体的说法，错误的是()A基因表达载体的构建是在生物体外完成的B任何基因表达载体的构建都是一样的，没有差别C图中启动子位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位D抗生素抗性基因的作用是作为标记基因，用于鉴别受体细胞中是否导入了目的基因答案B解析由于受体细胞有植物、动物和微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方式不同，所以基因表达载体的构建也会有所差别，不可能千篇一律。5如图是利用基因工程技术培育转基因植物生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中Pst、Sma、EcoR、Apa为四种限制性核酸内切酶。下列说法错误的是()A图示过程是基因工程的核心步骤B表达载体构建时需要用到限制酶SmaC抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来D除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构答案B解析图示过程为基因表达载体的构建过程，是基因工程中的核心步骤。构建过程中需要将目的基因完整切割下来，此时要用到限制酶Ps
