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1、我带领班子成员及全体职工，积极参加县委、政府和农牧局组织的政治理论学习，同时认真学习业务知识，全面提高了自身素质，增强职工工作积极性，杜绝了纪律松散第5课时微生物的实验室培养(二)学习导航1.通过阅读教材P1617“(一)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基”，掌握配制培养基的步骤和倒平板操作的过程。2.结合教材P1819“(二)纯化大肠杆菌”，理解并掌握利用平板划线法和稀释涂布平板法来纯化微生物的方法。重难点击1.掌握制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的方法。2.学会用平板划线法和稀释涂布平板法纯化微生物。一、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基牛肉膏蛋白胨固体培养基是细菌培养中常用的一种培养基，大肠杆菌的纯化就是用的
2、该培养基。1.牛肉膏蛋白胨培养基的成分及各成分提供的营养培养基组分提供的主要营养物质牛肉膏5.0 g碳源、氮源、磷酸盐和维生素蛋白胨10.0 g碳源、氮源和维生素NaCl 5.0 g无机盐蒸馏水定容至1 000 mL氢元素、氧元素2.制备步骤(1)培养基的配制计算：根据牛肉膏蛋白胨培养基配方的比例，计算配制100 mL培养基时各成分的用量称量溶化调节pH：1 moL的NaOH、pH试纸，将pH调为7.4 7.6分装：趁热分装到洁净锥形瓶中加棉塞：用棉花不用脱脂棉，脱脂棉吸水包扎：外包牛皮纸，且挂标签(2)灭菌(3)倒平板将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞
3、。右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰。用左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖。等待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置。1.填表比较溶化时两次使用玻棒搅拌的目的操作搅拌的目的往烧杯中加入蛋白胨和氯化钠后用玻棒搅拌促使蛋白胨和氯化钠溶解加入琼脂，加热使其熔化的过程中使用玻棒搅拌防止琼脂糊底而导致烧杯破裂2.倒平板时的注意事项(1)培养基灭菌后，需要冷却至50 左右时，才能倒平板的原因是什么？你用什么办法来估计培养基的温度？答案琼脂是一种多糖，在98 以上熔化，在44 以下凝固，倒平板时高于50 则会烫手，低于50 时若不及时操作，琼脂会凝固。
4、可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。(2)分析下图，回答、问题：为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答案通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。从防止杂菌污染的角度思考，平板冷凝后将平板倒置的原因是什么？答案平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染。(3)怎样判断制备的培养基是否合格、成功，是否受到污染？答案未接种的培养基在恒温箱中保温一段时间后，如果无菌落生长，说明培养基制备成功、合格，未受到污染。1.某学校开展大肠杆菌培养活动，
5、首先对实验室进行清扫和消毒处理，然后准备各种原料和用具。请回答下列问题：(1)对买回来的菌种进行扩大培养，首先制备试管培养基，写出制备牛肉膏蛋白胨固体培养基所需的原料： 。(2)微生物在生长过程中对各种成分需求量不同，配制培养基时各成分要有合适的 。在烧杯中加入琼脂后要不停 ，防止 。(3)将配制好的培养基分装到试管中，加棉塞后若干支试管一捆，包上牛皮纸并用皮筋勒紧放入 中灭菌。灭菌完毕后拔掉电源，待压力表的压力自然降到0时，将试管取出。如果棉塞上沾有培养基，此试管应 。答案(1)牛肉膏、蛋白胨、蒸馏水、NaCl、琼脂(2)比例搅拌琼脂糊底引起烧杯破裂(3)高压蒸汽灭菌锅废弃2.制备各种牛肉膏
6、蛋白胨固体培养基，关于倒平板的具体描述正确的是()待培养基冷却至40 左右时，在酒精灯火焰附近倒平板将灭过菌的培养皿放在桌面上，左手拔出棉塞右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰用左手的拇指和食指完全打开皿盖右手将锥形瓶中培养基倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖等待平板冷却510 s，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上A. B. C. D.问题导析(1)培养基灭菌后，需冷却至50 左右时才能倒平板，原因是琼脂在44 以下凝固。(2)倒平板的过程要在酒精灯火焰附近进行。答案C解析琼脂是一种多糖，在98 以上可溶解于水，在44 以下凝固，倒平板时高于50 则会烫手，低于50 时若不能及时操作，琼脂
7、会凝固。无菌操作应贯穿于操作的全过程，皿盖全打开则空气中的微生物会进入培养基。等待平板冷却凝固(大约需510 min)后，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上。一题多变倒平板的过程需要进行无菌操作，在培养基的制备过程中，还有哪些环节需要进行无菌操作？答案要对培养基进行高压蒸汽灭菌，对培养皿进行干热灭菌，酒精灯火焰旁属于灼烧灭菌。二、微生物的分离与纯化技术1.纯化大肠杆菌(1)平板划线法原理：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。步骤接种环灭菌：将接种环放在酒精灯火焰上灼烧直至烧红取菌种培养：将平板倒置，放入培养箱中培养(2)稀释涂布平板法原理：
8、将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。步骤.系列稀释操作a.编号为101106试管中分别盛有9 mL水。b.用移液管吸取1 mL培养的菌液，注入101倍稀释的试管中，得到稀释菌液。c.从101倍稀释的试管中吸取1 mL稀释液，注入102倍稀释的试管中。依次类推，完成菌液的稀释。注意移液管要经过灭菌，并且操作应在酒精灯火焰附近完成。.涂布平板操作涂布器消毒：将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中取菌液：取少量菌液滴加到培养基表面涂布器灭菌：将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却810 s涂布平板：用涂布器将菌液均匀涂布在培养基表面，涂布
9、时可转动培养皿，使菌液分布均匀2.菌种保藏比较项目临时保藏甘油管藏适用范围频繁使用的菌种长期保存的菌种培养基固体斜面培养基液体培养基保藏温度4 20 具体方法接种到固体斜面培养基上适宜温度下培养4 冰箱中保藏甘油瓶中装入甘油后灭菌将菌液转移至甘油瓶中混匀后冷冻箱中保存1.平板划线操作注意事项(1)平板划线法接种菌种时，哪些操作可防止杂菌污染？答案接种前将接种环放在酒精灯火焰上灼烧。划完一个区域后，将接种环灼烧，冷却后再划下一区域。接种环沾取菌液时，要将试管口、棉塞等通过火焰。划线时将培养皿打开一条缝隙，将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内。(2)在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？答案
10、避免接种环温度太高，杀死菌种。(3)为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？答案操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物。每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。(4)在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？答案需要。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。(5)在做第二次划线以及其后的操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？答案划线后末端含有的细菌数
11、目较少，每次从上一次的末端开始划线能够使细菌的数目随划线次数的增加而逐渐减少，最终分散成单个的细菌。(6)为何最后一次划线不能与第一次划线相连？答案最后一次划线已经将细菌稀释成单个的细胞，如果与第一次划线相连则增加了细菌的数目，得不到纯化的效果。2.稀释涂布平板操作注意事项(1)涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想将菌液滴加到培养基上时应如何进行无菌操作？答案应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适，吸管头不要接触任何其他物体，吸管要在酒精灯火焰附近等。(2)操作结束后，为什么要将一个未接种的培养基和一个接种的培养基放在一起
12、培养？未接种的培养基表面是否有菌落生长很关键。如果有菌落生长，说明了什么？答案培养未接种培养基的作用是对照。未接种的培养基在恒温箱中保温12 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的；若有菌落生长，说明培养基灭菌不彻底，或培养基被污染，需要重新制备。归纳总结两种接种方法比较平板划线法稀释涂布平板法用途一般用于菌种的纯化一般用于筛选菌株优点可对混合菌进行分离可以计数缺点不能计数较麻烦，平板干燥效果不好；若菌液浓度大则长不出单菌落培养结果3.稀释涂布平板法是微生物培养中常用的一种接种方法。下列相关叙述错误的是()A.操作中需要将菌液进行一系列的梯度稀释B.需将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基表
13、面C.不同浓度的菌液均可在培养基表面形成单个菌落D.操作过程中对培养基和涂布器等均需进行严格灭菌处理答案C解析稀释涂布平板法要先将菌液进行一系列的梯度稀释，A项正确；只有在稀释度足够高的菌液中，聚集在一起的微生物才被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个菌落，故而要将不同稀释度的菌液分别涂布平板，B项正确、C项错误；在稀释涂布过程中，为防止杂菌污染，要对培养基和涂布器等进行严格灭菌处理，D项正确。一题多变(1)B项中不同稀释度的菌液一般涂布几个平板为宜？答案为保证结果准确，每个稀释度的菌液一般涂布3个平板，并对结果取平均值。(2)如何证明该接种过程是成功的？答案将接种后的培养基和一个未接种
14、的培养基都放入适宜温度的恒温箱中，培养12 h和24 h后，观察培养基上的菌落情况，若未接种的培养基上无菌落生长，则证明操作是成功的；否则不成功。(3)题中如果不同稀释度的菌液接种后都不能得到单细胞菌落，原因可能是什么？答案可能是稀释度不够，聚集在一起的微生物没能被分散成单个细胞。(4)如果不进行D项操作，培养基上的菌落可能有哪些变化？答案菌落种类和数目增多。4.图甲是稀释涂布平板法中的部分操作，图乙是平板划线法操作结果。下列叙述中，错误的是()A.甲中涂布前要将涂布器灼烧，冷却后才能取菌液B.对于浓度较高的菌液，如果甲中的稀释倍数仅为102，则所得的菌落不是由单一的细胞或孢子繁殖而成C.乙中培养皿中所得的菌落都符合要求D.乙中的连续划线的起点是上一次划线的末端问题导析(1)对菌液进行稀释时，菌液中菌体的浓度越高，则稀释的倍数也要越高，菌体的浓度低时，则稀释的倍数不必太高。(2)高温会杀死菌体，所以一些经过高温或灼烧灭菌的器材需要冷却后才能接触菌种。(3)平板划线法的多次划线中，菌体越来越少，即不同划线处的菌体数目不同，所以形成的菌落并非全
