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1、灭 菌工艺及灭菌设备验证,黑龙江省所姜连阁 2013年1月,一般指没有活体微生物存在的药品。在药品制剂类别中，无菌药品也可称为无菌制剂 无菌药品是指法定药品标准中列有无菌检查项目的制剂和原料 -药品生产质量管理规范（2010年修订）附录1.无菌药品,无菌药品,基 本 概 念,？,灭菌,106 100（1） 10-6（10-3）,无菌保证水平（Sterility Assurance Level）-SAL,基 本 概 念,采用湿热灭菌法的SAL不得大于10-6，即灭菌后微生物存活的概率不得大于百万分之一 采用无菌生产的SAL不得大于10-3 无菌生产工艺仅限于临床必需注射给药而确实无法耐受终端灭菌
2、的产品,适用于粉针剂或部分小容量注射剂,SAL定义-产品经灭菌/除菌后微生物残存的概率。 评价灭菌（无菌）工艺的效果，该值越小，表明产品中微生物存在的概率越小。,无菌制剂主要有： 注射剂 植入剂、冲洗剂、眼内注射溶液、眼内插入剂 供手术、伤口、角膜穿通伤用的眼用制剂， 用于手术、创伤、烧伤或溃痒等的软膏剂、乳膏剂、气雾剂、喷雾剂 局部用散剂、耳用制剂、鼻用制剂、凝胶剂,基 本 概 念,注射剂 药途径 特 点,基 本 概 念,直接进入组织或血液 吸收快 作用迅速可靠,注射液 注射用无菌粉末 注射用浓溶液,肌肉注射 静脉注射,注射剂与其他剂型相比 无菌制剂, 质量要求高 生产过程控制严格,注射剂
3、-将药物制成无菌溶液、混悬液或临用前制成液体的无菌粉末供注入人体的制剂. 是临床上使用广泛的制剂。,无菌 无热原 无不溶性微粒 高纯度,无菌药品特点,？,基 本 概 念,微生物微粒 药物降解 （氧化、水解）,基 本 概 念,过滤、消毒、灭菌,工艺控制（PH、温度、时间、空气）,注射剂生产的基本要求,合理的厂房、设备、措施设计 合格的人员 合理的生产方法、步骤和控制方法 工艺验证和方法 灭菌工艺验证,生产场所 设施 设备 重要的支持系统 原材料 包装材料 产品设计 分析化验规程 仪器校准 操作人员 验证过的工艺,硬 件 软 件 人 员,微生物基础知识,真核微生物,原核微生物,病毒,有细胞结构,微
4、生物,无细胞结构,微生物-,是指一类体积微小、结构简单，大多是单细 胞的，必须用光学显微镜观察形态的微小生物的通称。,肉眼看不见、看不清楚的微小生物,微生物基础知识,个体小，作用大。 分布广，种类多。 生长繁殖快，代谢强。 易变异。,微生物基础知识,微生物生物学特征,植物叶子表面附生微生物- 皮肤上含细菌- 洗过后几小时之内- 人的肠道内微生物- 粪便中细菌- 一般人每个喷嚏的飞沫- 感冒患者一个喷嚏-,微生物基础知识简介,约100万个/克。 约10万个/cm2 恢复到原来的数量 约100万亿 大约占粪便干重的1/3 含4500-150000个 含8500万个（有传染性）,微生物无处不在,常见
5、微生物,微生物基础知识简介,微 生 物 分 布 特 点,G+,G-,细菌芽胞的形成及其特性,摘自 http:/www.microbe.org/microbes/spores.asp,内生孢子 产生于 Gram+ 细菌: 芽孢杆菌属Bacillus 梭菌属Clostridium,仅含核酸及少量萌发必需物，皮层含DPA和Ca2+复合物，能抵御各种恶劣环境，可休眠上百万年。真菌孢子因不具上述特性，而不耐热。（DPA：吡啶二羧酸）,常用的灭菌方法二种：物理灭菌法和化学灭菌法 物理灭菌技术是利用蛋白质与核酸具有遇热、射线不稳定的特性，采用加热、射线和过滤方法，杀灭或除去微生物的技术称为物理灭菌法，亦称物
6、理灭菌技术。该技术包括干热灭菌、湿热灭菌、除菌过滤法和辐射灭菌等。 化学灭菌法系指用化学药品直接作用于微生物而将其杀灭的方法，可分为气体灭菌剂和液体灭菌剂，如环氧乙烷属于气体灭菌剂的一类。 一旦温度超过上限，微生物细胞中主要的蛋白质、酶及核酸便会被永久性破坏，细胞膜被融解，从而导致细胞发生不可逆转的死亡。 热力学灭菌是使用最普遍并且研究最为彻底的灭菌方式。,灭 菌 基 本 原 理,灭 菌 基 本 原 理,微生物的耐热性可按下列顺序排列(耐热性从高到低): 绝大多数细菌45不能生长，80100可被迅速杀灭。 需氧菌中的芽胞杆菌属 厌氧菌中的梭状芽胞杆菌属,具有较强的耐热性,物理/化学条件 在较高
7、温度下生长 有二价阳离子 温度和相对湿度 在90 125之间，相对湿度在20% 50%时，细菌芽胞表现出最大的耐热性 当相对湿度超出这一范围时，芽胞的耐热性将会迅速下降。 湿度对芽胞破坏性过程起促进作用，所以湿热灭菌较干热灭菌较低温度。,影响热力灭菌的因素,湿热灭菌法系指物质在灭菌器内利用高压蒸汽或其他热力学灭菌手段杀灭细菌。（一定压力下的蒸气进行灭菌，也采用过热水喷淋或浸没）。 湿热灭菌法系导致细胞内的关键性蛋白质和酶发生热变性或凝固。 具有穿透力强，传导快，灭菌能力甚强。【水由液态变成气态时，会吸收大量的热能(540cal/g)，气态冷凝成液态时，会释放相等的能量(即汽化热)】。因此应尽可
8、能使用饱和蒸汽进行灭菌。 湿热灭菌是一种十分经济有效的方法。用于药品、药品的溶液、玻璃器械、培养基、无菌衣、敷料以及其他遇高温与湿热不发生变化或损坏的物质，均可选用。 常见湿热灭菌器包括脉动真空灭菌器（或称预真空灭菌器）、蒸汽-空气混合物灭菌器和过热湿热灭菌水灭菌器等。,湿 热 灭 菌,干热灭菌是指在非饱和湿度下进行的热力学灭菌。灭菌介质通常为被灭菌品所处湿度下的热空气干热灭菌是使微生物氧化而不是蛋白质变性，这就是干热灭菌之所以要求相对较高温度的原因。 利用干热灭菌工艺灭菌温度高、时间长的这一特点如170-250，甚至更高，可使干热灭菌同时具备除热原的功用。干热是去热原最为有效的方法之一。干热
9、去热原工艺进行验证，应证明该工艺能使标准内毒素至少下降3个对数单位。 在制药工业中，干热灭菌被广泛用于不耐受高压蒸气的热稳定性物品的灭菌。如玻璃、金属设备、器具，不需湿气穿透的油脂类（甘油、油类、凡士林、石蜡），耐高温的粉末化学药品（滑石粉、磺胺类药物）等，但不适用于橡胶、塑料及大部分药品。 革兰阴性细菌细胞壁中的脂多糖-内毒素。低剂量内毒素会导致人体发热反应，故而也称之为热原。,干 热 灭 菌,使用范围可分为试验室器具用，生产制剂用，生产器具用干热灭菌设备。 按使用方式分为连续式和批量式， 批量式干热灭菌设备如干热烘箱，可用于内毒素检验用玻璃、金属器具的灭菌和除热原，以及生产设备部件、生产器
10、具的灭菌除热原； 连续干热灭菌设备，如隧道烘箱，可用于小容量注射剂的生产。 按加热方式可分为：以辐射加热为主的热辐射式干热灭菌机和以对流加热为主的热层流加热式干热灭菌机等。,干 热 灭 菌,在特定温度下，任一时间点的芽胞死亡特性仅与这个时间点的芽胞浓度相关。,微生物的热致死特性,半对数座标,Y轴：微生物取对数 X轴：时间为10进制普通座标,无菌的影响因素可用下式表示: PNSU=N0-DR PNSU指非无菌品概率 N0指灭菌前产品的污染水平 DR指灭菌时的杀灭水平。 最终产品的无菌质量取决于两个因素 灭菌前的含菌量控制 灭菌工艺的杀灭效果。,微生物的热致死特性：受热死亡速度符合一级动力学方程
11、dN/dtK(N0Nt) N0为t0时，存活的微生物数； Nt为t时被杀灭的微生物数； N为t时存活的微生物数 K为常数。 将上式积分得到： lgNt lgN0(K2.303)t,专 业 名 词,它是分析灭菌工艺效果的重要生物学参数。并且其数值可通过残存曲线法或阴性分数法加以确定。 lgN0lgNtlg（N0Nt） t(K2.303)lgl01, 所以D= t=2.303K. 即：D是直线斜率的负倒数 D 值越大，该温度下微生物的耐热性就越强，在灭菌中就越难杀灭。,对某一种微生物而言，在其他条件保持不变的情况下，D 值随灭菌温度的变化而变化。 灭菌温度升高时，直线方程的斜率变大，即使微生物杀灭
12、90所需的时间就短 灭菌温度低时，达到同一灭菌效果的时间就长,在湿热灭菌条件下，实验测得细菌芽胞的z值在8-12之间 湿热灭菌计算时z通常取10；干热灭菌计算时Z通常取20，去热原时Z通常取54 。 Z=直线斜率的负倒数, 其中:D1指温度为T1时的D值， D2指温度为T2时的D值。,Z=-T/D =(Tl-T2)/log10 (D2/D1)，,F0D l21LgN FTDTLgN 达到同样灭菌效果时，LgN 等值,指在某一温度T()下灭菌1min 所获得的标准灭菌时间,所以 F0FTD121DT,L= D121/Di =10 (Ti-121)/Z Ti指各个灭菌时段的温度 标准参照温度（12
13、1） Z10。,100灭菌时1分钟，相当于121 灭菌0.008分钟，即Fo值为0.008分钟。 105灭菌40分钟时，Fo约为 1分钟，能使D值为1分钟的芽孢数量下降1个对数单位 116下灭菌lmin 对芽孢杀灭效果只有标准灭菌状态下的32 121下灭菌lmin 相当于116下灭菌3.16min,可用灭菌率计算FT值=F0L=8/0.316=25.3 F0=10 (Ti-T121)/Z dt=10 (116-121)/10 *25.3=8 根据梯形规则，将整个灭菌过程(包括升温、保温和冷却阶段)的灭菌率累加，从而估算出某灭菌程序在标准温度下的等效灭菌时间： F0=t（L1/2+L2+L3+L
14、n-1+Ln/2）, t指测量温度的时间间隔。每两次测量温度的时间间隔必须相同。在初始及结束时间段的灭菌率非常小,可将公式简化为:FT=tL。,由 FT(LgN0LgNT)DT， FTDT LgN0LgNT，则lgNTlgN0FTDT。根据灭菌设备内温度监控系统所测得的物理参数，估测某灭菌程序对微生物的杀灭效果。 DT表示某实际微生物（待灭菌物品中的污染菌)或假设的微生物(生物指示剂)在T下的D值。 例如，假设F0为8分钟，DT=0.5分钟，数量为106，由公式可以得出在灭菌结束时，芽胞的残存数量为10-10，SAL=lgNT =6-8/0.5=-10。 在整个灭菌过程中，芽胞数量的对数下降值
15、: SLR=LgN0-LgNT= FTDT =6-(-10) =8/0.5=16。,生物指示剂，简称为BI，是对特定灭菌者 工艺具有一定耐受性并且能够定量测定灭 菌效力的微生物制剂， 生物指示剂多为芽胞类细菌，具有更强的耐受性。 生物指示剂既可用来测定一个给定的灭菌工艺条件的灭菌效果，也可判别它是否符合无菌保证要求。 采用生物指示剂做对照试验，是评判一个灭菌程序有效性的直接方法而且也是最佳方法。,常用于灭菌工艺验证的生物指示剂主要有三种形式 芽胞条 芽胞悬浮液 自含型生物指示剂,芽胞条 将芽胞接种于滤纸片、玻璃、塑料等薄片或条状物，并用特定的材料包起来以保持其完整性和生物活性。直接接种到产品中. 适用于验证和监控非溶液类物品的灭菌工艺.,芽胞悬浮液 芽胞悬浮液可被接种待灭菌产品溶液或模拟产品溶液中。直接接种于产品内或产品外表面，这样能更加直观地考察产品的实际灭菌效果。 芽胞接种到液体产品时，其耐热性会增强或降低。如果不宜被直接接种于产品或耐热芽胞与产品不相适应，则可用模拟产品（生理盐水或其他溶液）替代。 但必须保证所用的替代品与产品具有相似的物理和化学性质(如粘度和pH)，并且耐热芽胞在替代品中的D值（耐热性）不得小于在产品中的D值。否则将影响到灭菌工艺验证或日常监
