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1、HIV-1耐药及耐药检测,中国医科大学附属第一医院 艾滋病研究所 张 旻,HIV病毒模式图,HIV病毒颗粒由基因组RNA、外膜蛋白Env、衣壳蛋白Gag、逆转录酶RT，蛋白酶PRO及整合酶IN组成,HIV生活周期,吸附穿入脱壳生物合成组装成熟和释放,HIV基因组模式图,我国及国际两种不同抗HIV治疗方案效果比较,注：上标字母相同表示组间无显著差异，上标字母不同表示组间差异显著,项目周期:五年,2005年7月-2010年6月。第一期两年，2005年7月-2007年6月全球基金将根据第一期执行情况确定后三年的投入。 项目实施地区：广西、贵州、湖南、江西、四川、新疆、云南个省（自治区） ，35个地(
2、州、市），76个项目县（市、区）。,总经费预算：五年总经费为9807万美元,其中全球基金支持约6374万美元,中国政府配套约3433万美元.配套比例逐年增加，由第一年的20%，增加到第五年的50%。 两年经费预算：二年预算约为3100万美元,其中全球基金支持约2400万美元,中国政府配套约700万美元. 。,目标六：建立服务网络，确保针对艾滋病病人/感染者开展的治疗、关怀和支持等活动的开展，包括母婴阻断。 活动：在项目省建立和运转耐药监测实验室,开展耐药监测工作,帮助扩展和改进国家耐药监测网络 各省省级建立实验室 定为哨点的项目县按方案采集血样,需要了解的主题:,什么是耐药性? 药物的作用靶点
3、与机制? 与病毒的哪些基因有关? 耐药性是怎么产生的? 那些因素促使耐药性病毒株出现? 耐药性分类与耐药机制。 如何检测耐药株? 检测中注意事项。,什么是HIV耐药性?,HIV耐药性是指病毒通过自身的遗传变异，产生对药物抑制作用，使药物敏感性降低或不敏感的现象。,什么是HIV耐药性?,IC50 = 50% 抑制浓度,药物的作用靶点与机制?,药物的作用靶点与机制：,Antiretroviral Drugs 2004,NRTIs NNRTIs PIs Zidovudine Nevirapine* Saquinavir Didanosine Delavirdine Ritonavir Stavudi
4、ne Efavirenz* Indinavir Lamivudine* Nelfinavir* Zalcitabine Amprenavir Abacavir Lopinavir/r Combivir Atazanavir Trizivir Fosamprenavir Didanosine EC Stavudine SR FTC,Nucleotide RTI Tenofovir Entry Inhibitors T20,药物的作用靶点与机制：,耐药性是怎么产生的?,病毒自身因素 内因 药物的选择压力 外因,耐药性是怎么产生的?,病毒自身因素 内因 HIV-l的逆转录酶（RT）不具有DNA聚合酶
5、的校正功能， 因此，在复制过程中，病毒核酸表现出高度的错误倾向性。 在病毒的高速复制过程中，高频率突变在很短的时间内随 时发生。 每个复制周期产生一个突变点； 每天产生109 1010 个新病毒； 病毒基因组中平均每个碱基每天突变一次,耐药性是怎么产生的?,药物的选择压力 外因 在药物选择压力下，耐药变异株完全取代药物敏感株最快 能发生在14 至28天内。,“Wild” type virus (drug susceptible),“Mutant” virus (drug resistant),Drug Pressure,TIME,Viral Dynamics and Drug Resistan
6、ce,Viral Load & Replication Rate,Viral Load & Replication Rate,TIME,Low Replication Rate & Viral Load Less “fit” virus,Pressure: Drug A,Pressure: Drug B,Pressure: Drug C,(Combined) Use of Active Antiretroviral Agents,耐药性是怎么产生的?, 耐药株是在病毒自发性的、高频率的基因突变中产 生，在药物选择性的压力下优势复制的结果。,那些因素促使耐药性病毒株出现?,1.,那些因素促使耐药
7、性病毒株出现?,病毒学失败率 (%),0,20,40,60,80,100,95,90-95,80-90,70-80,70,服药依从性 (%),82.1,71.4,66.7,54.6,21.7,2.,那些因素促使耐药性病毒株出现?,服药依从性 (%),2.,那些因素促使耐药性病毒株出现?,药物配伍不当 药代显著不同药物配伍,3.,那些因素促使耐药性病毒株出现?, 细胞周期依赖性药物 AZT, D4T ( 活化期细胞) DDI (静止相细胞) 蛋白酶抑制剂 (活化期细胞) 非细胞周期依赖性药物 3TC, FTC, Abacavir Tenofovir NNRTIs,3. 药物配伍不当 缺乏对某一时
8、相细胞内病毒抑制或抑制不足,那些因素促使耐药性病毒株出现?, 胃肠道吸收不好：呕吐，腹泻； 随意间歇服药； 与中药或其他药物同时服用。,4. 其他因素,什么是好治疗方案?, 能快速抑制病毒； 不易产生耐药性； 可长期维持；,耐药性分类,1、原发性耐药(Primary resistance): 病人在接受抗病毒治疗前产生了药物作用靶点的变异，或者感染了耐药毒株，均降低抗病毒药物的敏感性。在已经开展HAART的国家普遍存在，感染了耐药毒株的病人很容易引起药物治疗失败。 2、继发性耐药(Secondary resistance): 病人已经接受了抗病毒治疗并产生治疗失败，在药物的选择压力下产生的耐药
9、。,耐药机制：,核苷和核苷类似物 1、破坏核苷类似物结合病毒DNA的能力 M184V 突变: RT酶第184位密码子 的氨基酸由蛋氨酸(M)变成为缬氨酸(V) 。拉米夫定(Lamivudine) Q151M mutation: 在HIV-1中出现低于 5%；HIV-2中出现频率较高。,耐药机制：,2、切除病毒DNA链末端的核苷类似物 Thymidine analogues mutations: 突变引起ATP或者焦磷酸介导的切除DNA链3末端核苷类似物。,核苷和核苷类似物,耐药机制：,非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI) 突变降低了抑制剂对酶的结合力。不同于核苷逆转录酶抑制剂，其单一突变就能导致
10、高度耐药。如K103N、Y181C。,耐药机制：,K103N突变的机制,耐药机制：,蛋白酶抑制剂,突变点的表示方法：,基因的突变通常以字母数字字母的书写方式来表示，第一个字母代表野生型病毒株特定密码子处的氨基酸，第二个字母代表在特定密码子处替换了的氨基酸，中间数字表示突变点的位置。例如：逆转录酶（RT）K103N的突变表示逆转录酶第103位密码子的氨基酸由天冬酰胺（K）变成为赖氨酸（N）。,如何检测耐药株：,目前耐药性检测有两种方法，即表型检测及基因型检测。表型检测通过用药期间的病毒培养进行，而基因型检测则通过分子生物学方法检测与耐药性相关的病毒基因突变。基因型检测的费用较低，技术也相对容易，
11、可在样品收集后12周得到结果，但分析基因型耐药检测时，需要掌握大量相关知识，如突变与抗病毒药物及其它药物的交叉耐药等，才能对结果进行正确的分析。表型检测可以直接检测病毒的耐药性，但操作复杂、耗时，技术要求高，且非常昂贵，因此目前国际上广泛应用于临床的是基因型耐药检测。,如何检测耐药株：,基因型和表型检测,检测中注意事项:, 在病人仍在治疗失败的方案上收集样品，可保 证耐药株占总病毒量的20%以上； 病毒载量 1000时, 可出现假阴性。,我国HIV耐药性本底抽样调查结果,1)对于RT基因区共完成对21个省区共143个样本的测序，仅有2例发现具有轻微耐药（占总样本数的1.4%） 2)对于蛋白酶基
12、因区本次调查共完成20个省区168个样本的分析，仅发现有2例样本（占总样本数1.21%）具有轻微耐药。 结论：当前我国HIV耐药性处于较低状态，对于几乎所有药物敏感，我国抗HIV药物的使用如果有计划的开展，应当会有较好的效果，但应加强治疗依从性促进工作和耐药毒株的监测工作。,HIV基因型耐药性检测 （序列测定法）,检 测 流 程,病人血浆标本,HIV RNA,病毒 cDNA,HIV RT和PR基因片段,序列测定,结果解释,RNA提取,逆转录,PCR扩增,特定的解释系统,标本 新鲜EDTA抗凝血浆，或-80保存，避免反复冻融,病毒RNA提取（ Qiagen公司试剂盒）,裂解标本，灭活RNA酶,加
13、到离心柱中，RNA与硅胶膜结合,洗两次，去除杂质,用无RNA酶的缓冲液洗脱RNA,收集RNA备用,优点：操作简便、快速、得率高,逆转录 RNA cDNA,反应体系： 10XBuffer 1l dNTP 0.5l 外侧反向引物 1l RNase inhibitor 0.25l M-MuLV RT 0.25l DEPC水 2l RNA模板 5l 42水浴1小时，95 5分钟灭活RT,巢式PCR扩增病毒蛋白酶和逆转录酶基因,第一轮扩增反应体系： 10XBuffer 5l MgCl2 3l dNTP 1l 外侧正向引物 1l 外侧反向引物 1l Taq酶 0.5l 水 29.5l cDNA模板 10l
14、 945min，9430sec，5530sec，722.5min 30循环,巢式PCR扩增病毒蛋白酶和逆转录酶基因,第二轮扩增反应体系： 10XBuffer 5l MgCl2 3l dNTP 1l 内侧正向引物 1l 内侧反向引物 1l Taq酶 0.5l 水 29.5l 第一轮扩增产物 10l 945min，9430sec，5530sec，722.5min 30循环,扩增产物鉴定：琼脂糖凝胶电泳,扩增产物纯化 QIAquick Gel extraction试剂盒 核酸序列测定 双脱氧链末端终止法,: Protease: CCTCAAATCACTCTTTGGCAACGACCCCTCGTCACA
15、GTAAAGATAGGGGGGCAATTAAAGGAAGCTCTATTAGATACAGGAGCAGATGATACAGTATTAGAAGAAATGAATTTGCCAGGAAAATGGAAACCAAAAATGATAGGGGGAATTGGAGGTTTTATCAAAGTAAGACAGTATGATCAGGTATCCATAGAAATCTGTGGACATAAGGCTGTAGGTACAGTATTAATAGGACCTACACCAGTCAACATAATTGGGAGAAATCTGTTGACTCAGATTGGTTGCACTTT RT: AAATTTTCCCATTAGTCCTATTGAAACTGTACCAGTAAAATTAAAGCCAGGAATGGATGGCCCAAAAGTTAAACAATGGCCATTGACAGAAGAAAAAATAAAAGCATTAGTAGAAATTTGTACAGAAATGGGAAAGGAAGGAAAAATTTCAAAAATTGGGCCTGAAAATCCATACAATACTCCAGTATTTGCCATAAAGAAAAAAGACAGTACTAAATGGAGAAAATTAGTAGATTTCAGAGAACTCAATAAAAGAACTCAAGACTT
