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1、1. 结核病背景资料,2. 结核病病原学实验室诊断,3.体外r-干扰素释放试验,4.小 结,背景结核病流行现状,全球有三分之一人口（20亿）感染了结核杆菌 我国现患肺结核病人达500万，占全球病人总数的1/4,背景结核病感染、传播、发病过程,潜伏感染 染,肺病或其他疾病,潜伏感染,复发,细菌在人体复制,播散 Disseminates,发作 Onset,康复 Recovery,时间表Time,诊断 Diagnosis,治疗 Treatment,痊愈, 2 个月（months）,背景当前结核病的研究,新型抗结核药物(50%) 新型快速诊断技术(40%) 新型结核疫苗(10%),JID 2012:2
2、05 (Suppl 2), S147.,背景结核分枝杆菌基础,结核分枝杆菌（M. tuberculosis）简称为结核杆菌（tubercle bacilli）。早在1882年，德国细菌学家柯赫（Robert Koch）就已证明结核分枝杆菌是结核病的病原菌。本菌可侵犯全身各组织器官，但以肺部感染最多见。 在微生物分类中，结核分枝杆菌属于放线菌门、放线菌纲、放线菌目、分枝杆菌科、分枝杆菌属 分枝杆菌复合群共包括人型、牛型、非洲型和田鼠型，而人型结核分枝杆菌是人类主要的致病菌,背景结核分枝杆菌基础,（1）结核杆菌可经多途径感染，由呼吸道、消化道和破损皮肤侵入机体，最常见为经呼吸道感染引起肺结核。 （
3、2）结核杆菌无内毒素和外毒素，也不产生侵袭性酶，其致病性主要与其细胞壁内含大量脂质有关。主要包括： 磷脂：可刺激单核细胞增生，与结核结节和干酪样坏死形成有关 分枝菌酸：与抗酸染色性有关 索状因子：可破坏细胞线粒体膜，与慢性肉芽肿形成有关 硫酸脑苷酯：抑制吞噬溶酶体形成，具有抗吞噬作用 蜡质D，可刺激机体的迟发型超敏反应。 （3）结核杆菌主要引起细胞免疫反应，属于传染性免疫,背景-结核病患者的发现,症状： 肺结核病可疑症状者，主要指有咳嗽、咳痰二周以上者, 或有咯血症状者 发现方式： 因症求诊、转诊和因症推荐 是发现肺结核病人的主要方式,背景-结核病患者的诊断,肺结核诊断标准：按照新修订的肺结核
4、诊断标准（WS288-2008），肺结核分确诊病例、临床诊断病例和 疑似病例。,背景-结核病实验室的任务,Provide Early and Accurate Diagnosis 提供早期精准诊断 Initiation of right treatment and intervention early 制定正确治疗方案并早期干预 Monitoring therapy efficacy in a prompt manner 迅速的监测疗效 Treatment and diagnosis companion in tuberculosis drug development 在开发抗结核药物同时发展
5、新的治疗及诊断手段,结核病实验室诊断技术简介,1.结核抗体 2.结核蛋白芯片 3.体外r-干扰素试验 4.结核杆菌分泌抗原,1.涂片 2.培养 3.药敏 4.菌型鉴定,细菌学,免疫学,分子生物学,其 他,1.HPLC 2.质谱技术 3.流式技术,1.实时荧光定量PCR 2.DNA 3.RNA 4.耐药基因突变 5.菌型鉴定 6.测序,结核分枝杆菌形态学检测,1.直接抹片法 2.离心制片法,1.抗酸染色 2.荧光染色,1.普通显微镜 2.荧光显微镜 3.自动阅片技术,结核杆菌形态学检测-离心制片技术,2015年7月至2015年11月，对本院257例痰液和纤维支气管镜灌洗液进行直接涂片法和离心制片
6、法比对验证试验，结果如下：,结论：离心制片法的确能提高结核杆菌涂片检测的阳性率。,结核杆菌形态学检测-自动阅片技术,2016年2月至2016年3月，本院对308例涂片进行人工阅片和计算机自动阅片比对试验；结果符合的为286例，总符合率为92.58%。,结核病诊断金标准结核分枝杆菌培养,分枝杆菌全自动连续检测系统 -BACTEC MGIT 960 操作简单 安全可靠 性能优异 高性能价格比 M=Mycobacterium G=Growth I=Indicator T=Tube,结核病诊断金标准结核分枝杆菌培养,检测对象 CO2 O2 检测手段 颜色 荧光 发光元素 培养基 改良Middle Br
7、ook 7H9 营养添加剂 抑菌剂 灵敏，快速，安全,结核病诊断金标准结核分枝杆菌培养,简单的工作流程,结核病诊断金标准结核分枝杆菌培养,BACTEC MGIT 960 阳性结果判读 1.抗酸染色 2.普通培养血平板 3.MPB64抗原检测,结核病诊断金标准结核分枝杆菌培养,BACTEC 9120 只能做血培养？ 标本：血液、无菌体液,我可以的！- 普通细菌、真菌 分枝杆菌,结核分枝杆菌体外药敏试验,结核杆菌体外 药敏试验,MIC 测定法,固 体 培养法,液体 仪器法,液体 微量法,结核分枝杆菌体外药敏试验,药敏系统采用NCCLs 推荐的比例法(MOP)，判断的临界值为1% 药敏试剂包括: S
8、IRE Kit (Streptomycin, Isoniazid, Rifampin and Ethambutol) 4-13天 PZA Kit 4-21天 SIRE Susceptibility options: 另有单独包装的高浓度药物S，I，E (在低浓度耐药情况下，可用于高浓 度实验),BACTEC MGIT 960 药敏系统,结核分枝杆菌体外药敏试验,MGIT Plastic Tubes,BACTEC 960 SIRE KIT,Myco/F Lytic 25 pack,BACTEC 960 PZA Kit,960 direct LIS,BACTEC 960 for G&D,Manua
9、l MGIT,BACTEC 460TB,BACTEC 9000MB,2003 BD is always the LEADER,结核分枝杆菌药敏试验的金标准-MGIT960,EpiCenter for the 960,结核分枝杆菌体外药敏试验,Drug free Isoniazid Ethambutol Inoculum media 0.2 mcg/ml 2.0 mcg/ml 10-3 + + 3 10-5 26 9 0 % resistant 34.6 0.1 Interpretation Resistant Susceptible,结核分枝杆菌体外药敏试验,1,2,3,4,挑取菌落 磨菌、稀
10、释,接种菌液,孵育7-10天,显色， 读取结果,结核分枝杆菌液体微量药敏,结核分枝杆菌体外药敏试验,结核分枝杆菌液体微量显色法药敏试验 收集我院2015年8月至11月的临床分离菌株511例，使用液体微量显色法进行了利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇、卷曲霉素、氧氟沙星、乙硫异烟胺对氨基水杨酸、左氧氟沙星、莫西沙星、利福布丁、阿米卡星、卡那霉素、氯苯吩嗪等十四种抗结核药物的体外药敏试验 。其中MDR-TB菌株75例（14.7%）。,结核分枝杆菌体外药敏试验,结核分枝杆菌液体微量显色法药敏试验比对实验 收集临床分离菌株和国家参比室的质控菌株117例，使用液体微量显色法和罗氏比例法进行了利福平、异烟肼
11、、链霉素、乙胺丁醇、卷曲霉素、氧氟沙星、乙硫异烟胺、对氨基水杨酸、左氧氟沙星、莫西沙星、 利福布丁、阿米卡星、卡那霉素、 氯苯吩嗪等十四种抗结核药物的比对实验。 总符合率超过90%。,结核病分子生物学诊断,一、结核分枝杆菌探针溶解曲线技术,结核病分子生物学诊断,结 果 判 断,结核病分子生物学诊断,收集我院样本库的临床分离菌株154例，进行了溶解曲线法耐药基因突变分析以及罗氏比例法药敏试验，总符合率在96%以上。并对耐药结果不相符的11株菌进行了基因测序分析，均证实有耐药基因突变。,结核病分子生物学诊断,二、结核分枝杆菌RNA检测(TB-RNA) RNA作为临床分子诊断靶标的优点： RNA 拷
12、贝数 DNA拷贝数 更具临床意义: 生命力旺盛的病原体RNA转录活跃 RNA远不如DNA稳定，病原体死亡，RNA很快降解 1.交叉污染少 2.较好的愈后指标,结核病分子生物学诊断,统计今年我院住院患者179例，分析涂片、培养和TB-RNA检测报告，结果如下：,我院涂片、培养阳性率分别为：15.1%和37.9%；TB-RNA的总阳性率为35.8%。,结核病分子生物学诊断,三、EasyNAT TB-DNA检测（恒温扩增法） 原理：将病原体DNA扩增、核酸杂交和核酸试纸条检测三种技术有机地融为一体，在恒温扩增反应中加入两对TB特异性引物、一对特异性探针，同时 一次性完成TB DNA的扩增及杂交 过程
13、，然后用一次性核酸检测装 置进行定性诊断。 检测目标片段:目标为结核分枝杆菌 特异性IS6110片段。,结核病分子生物学诊断,操作步骤,结核病分子生物学诊断,2015年6月，我科参加CTCTC“EasyNAT结核分枝杆菌核酸检测试剂盒现场应用评估”项目,结果如下：,注*：1例培养阳性最终鉴定为非结核分枝杆菌,结核病分子生物学诊断,四、Gen-Xpert MTB/RIF 进行标本处理、实时PCR和利福平耐药性检测的完整平台 痰标本可以直接放入模块中，而无需与任何试剂进行混合处理 GeneXpert 设备可进行标本液化、去污染、富集、DNA提取、 rpoB实时扩增、应用分子灯塔检测耐药相关的突变
14、容易使用，不需要进行分子生物学培训 操作完全自动化， 使用起来既容易又安全。,结核病分子生物学诊断,Xpert MTB/RIF与PCR TB-DNA检测的比较： 阳性符合率99.03，阴性符合率92.61，总符合率95.31,结核病分子生物学诊断,涂片阳性肺结核: Xpert 检出率=99.35 涂片阴性肺结核: Xpert 检出率=35.32,结核病分子生物学诊断,Xpert MTB/RIF与BD960液体培养比较实验： 阳性符合率95.52，阴性符合率95.51，总符合率= 95.51,结核病分子生物学诊断,Xpert MTB/RIF与比例法药敏比较实验： 阳性符合率 96.88，阴性符合
15、率 95.53，总符合率 95.73，,结核病分子生物学诊断,WHO关于Xpert MTB/RIF的建议 Xpert MTB/RIF 应该用于MDR-TB的高危人群、以便尽早发现MDR-TB患者，有效控制疫情。 Xpert MTB/RIF 在MDR或HIV问题不十分严重的地区，可以考虑作为显微镜检查基础之上的后续检测，特别是用于涂阴标本的进一步检测。,体外r-干扰素释放试验,蛋白质水平,结核菌素试验（TST）,T-SPOT.TB,QuantiFERON-TB Gold in-tube (QFT-GI),体外r-干扰素释放试验, 干扰素 检测阴性,干扰素 检测阳性,体外r-干扰素释放试验,特异性 只针对结核分枝杆菌复合群敏感，与绝大多数环境分枝杆菌和卡介苗（BCG）无交叉反应 美国FDA数据：特异性97.1%(297/306) 国内临床数据：特异性94.1%(478/508) 灵敏度 基本不受免疫力低下/受抑制影响，在肺外结核患者中有很高的检出率 美国FDA数据：灵敏度95.6%(175/183) 国内临床数据：灵敏度95.3%(624/655),体外r-干扰素释放试验,实验效果图,体外r-干扰素释放试验,检测特异性的提高 帮助临床区分卡介苗接种和环境分枝杆菌感染引起的“假阳性”，避免了临床的无效用药 检测灵敏度的提高 有利于临床对结核病的
