《课件：高效液相色谱ppt课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《课件：高效液相色谱ppt课件（56页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、高效液相色谱讲议,主讲人：邓湘萍,.,高效液相色谱仪( HPLC),目前常见的HPLC生产厂家国外有Waters公司、Agilent公司（原HP公司）、岛津公司等，国内有大连依利特公司、上海分析仪器厂、北京分析仪器厂等。,俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906 年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。,液相色谱理论发展简况,色谱法的分离原理是：,溶于流动相中的各组分经过固定相时，由于与固定相发生作用（吸附、分配、离子、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。,色谱分离过程,液相色谱理论
2、发展简况,液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。,液相色谱理论发展简况,它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Sp
3、eed Liquid Chromatography，HSLP)。也称现代液相色谱。,HPLC系统,一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、预柱或保护柱、柱温控制器等，现代HPLC仪还有微机控制系统，进行自动化仪器控制和数据处理。制备型HPLC仪还备有自动馏分收集装置。,HPLC系统, 高压输液系统 进样系统 分离系统 检测系统,反相HPLC 极性:固定相 流动相 固定相 - 极性弱 流动相(甲醇, 乙腈等)- 极性强 极性大物质先出峰,正相HPLC 极性:固定相 流动相 固定相 -
4、极性强 流动相(己烷, 庚烷)- 极性弱 极性小物质先出峰,主流,固定相与流动相,.,色谱柱常用的pH值:,为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常为2.57.5（28），太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱可在pH 1.510范围操作。,检测系统,目前有两种基本类型的检测器: 专属型检测器 只能检测某些组分的某一性质 紫外检测器、荧光检测器 通用型检测器 检测一般物质均具有的性质 示差折光检测器、蒸发光散射检测器,紫外检测器（UVD）,工作原理：基于Lambert-Beer定律，即被测组分对紫外
5、光或可见光具有吸收，且吸收强度与组分浓度成正比。 优点: a: 灵敏度高 b: 线性范围广 C: 对温度和流速不敏感，适于进行梯度洗脱 限制: a: 没有紫外吸收的物质不能检测 b: 应尽可能选择在检测波长下没有背景吸收的流动相,原理:光电二极管阵列（或CCD阵列，硅靶摄像管等）作为检测元件的UV-VIS检测器。它可构成多通道并行工作，同时检测由光栅分光，再入射到阵列式接受器上的全部波长的信号，然后，对二极管阵列快速扫描采集数据，得到的是时间、光强度和波长的三维谱图。 应用 a: 色谱峰纯度检查 b: 色谱峰鉴定 三维色谱能提供更多全面的信息。,二极管阵列检测器(DAD),荧光检测器（FD）,
6、原理:物质的分子或原子经光照射后，有些电子被激发至较高的能 级，这些电子从高能级 跃至低能级时，物质会发出比入射光 波长较 长的光，这种光称为荧光。荧光检测器就是在样品的激发波长处检测发射光的强弱。,荧光检测器（FD）,优点: a: 灵敏度非常高(灵敏度在目前常用的HPLC检测器中最 高 )，适合于痕量分析 b: 可以用于梯度洗脱 c: 对仪器的稳定性（如温度和压力的稳定性）依赖较小 d: 选择性好，优于紫外 缺点: a:适用范围有一定的局限性 只适用于有荧光基团衍 生化之后有荧光基团的化合物 ,主要用于氨基酸、多环 芳烃、维生素、甾体化合物及酶等的检测。 b: 定量分析时线性范围较窄,示差折
7、光检测器（RI）,原理：样品组分的折射率与流动相折射率有差异，当组分洗脱出来时，会引起流动相折射率的变化，这种变化与样品组分的浓度成正比。 要点：化合物都可用这种检测器检出。灵敏度低，不能用于梯度洗脱。,蒸发光散射检测器（ELSD）,散射光强只与溶质颗粒大小和数量有关。 要点：可用于梯度洗脱 分析对象：适合于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品的检测,因而主要用于糖类、高分子化合物、高级脂肪酸、磷脂、维生素、氨基酸、甘油三酯及甾体类等几十类化合物。,谱图分析,基本概念和术语,色谱图(chromatogram)样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线(elution pr
8、ofile)。 基线(base line)经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。 噪音(noise)基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。 漂移(drift)基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移,基本概念和术语,色谱峰(peak)组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯Gauss曲线）。不对称色谱峰有两种：前延峰(leading peak)
9、和拖尾峰(tailing peak)。前者少见。 峰底基线上峰的起点至终点的距离。 峰高(peak height，h)峰的最高点至峰底的距离。,基本概念和术语,峰宽（peak width，W)峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。W4 半峰宽（peak width at half-height，Wh/2)峰高一半处的峰宽。Wh/22.355 峰面积(peak area，A)峰与峰底所包围的面积。 保留时间(retention time，tR)从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。,基本概念和术语,准确度指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，用百分回收率表示。 精
10、密度是指在规定条件下，同一个均匀样品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度,表示测定的重现性。用偏差（d）、标准偏差(SD )、相对标准偏(RSD )(变异系数，CV )表示。 信噪比即分析信号( Singnal )与空白信号的波动(噪音 , Noise )的比值。,基本概念和术语,检测限指在确定的实验条件下，HPLC能检测出待测物的最低浓度或含量。 (1)信噪比法 把已知低浓度试样测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，算出能被可靠地检测出的最低浓度或量。一般以信噪比（S/N）31或21时的相应浓度或量确定检测限。 (2)非仪器分析目视法 用已知浓度的被测物，试验出能被可靠地检测出的最低浓度
11、或量。,基本概念和术语,定量限指样品中被测物能被定量测定的最低量，结果应具有一定准确度和精密度要求。 (1)信噪比法确定定量限，一般以信噪比（S/N）为101时相应的浓度或注入仪器的量进行确定。 (2)按1984年国际纯粹和应用化学联合会(IUPAC)规定：用仪器所测空白背景响应标准差（SD）的10倍为估计值，再经试验确定方法的实际测定下限。,适用性试验,色谱系统的适用性试验通包括 理论板数 分离度 重复性 拖尾因子 分离度和重复性是尤为重要。,适用性试验,理论塔板数(n)用于评价色谱柱的分离效能。 在规定的色谱条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分
12、峰或内标物质峰的保留时间tR（以分钟或长度计，下同，但应取相同单位）和峰宽（W）或半 高峰宽（Wh/2）,按 n16（tR/W)2或 n=5.54(tR/Wh/2)2计算色谱柱 的理论板数。,适用性试验,分离度用于评价待测组分与相邻共存物或难分离物质之间的分离程度，是衡量色谱系统效能的关键指标。 除另外有规定外，待测组分与相邻共存物之间的分离度应大于1.5。,适用性试验,分离度的计算公式为： 2(tR2tR1) 2(tR2tR1) R 或 R W1W2 1.70（ W1，h/2W2,h/2） 式中 t R2为相邻两峰中后一峰的保留时间； tR1为相邻两峰中前一峰的保留时间； W1、W2及W1，
13、h/2、W2,h/2分别为此相邻两峰的峰宽及半高峰宽。 当对测定结果有异议时，色谱柱的理论板数（n）和分离度（R）均以峰宽（W）的计算结果为准。,适用性试验,重复性用于评价连续进样中，色谱系统响应值的重复性能。 采用外标法时，通常取各品种项下的对照品溶液，连续进样5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0； 采用内标法时，通常配制相当于80、100和120的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别至少进样2次，计算平均校正因子。其相对标准偏差也应不大于2.0。,适应性试验,拖尾因子(T)用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称因子或不对称因子。 中国药典规定
14、T应为0.951.05。 T0.95为前延峰，T1.05为拖尾峰。,HPLC法定性或定量,HPLC法定性常用于鉴别项。 通过与对照品保留时间的一致性来进行定性。,液相色谱分离定量分析,a:外标法 -外标一点法 含量（ C X ）= C R AX /AR CX为供试品浓度 AX为供试品峰面积 CR为对照品浓度 AR为对照品峰面积,液相色谱分离定量分析,b:内标法 校正因子（f）= AS CR /CS AR 含量（ C X ）= f AX CS /AS AX为供试品峰面积 CX为供试品浓度 AR为对照品峰面积 CR为对照品浓度 AS为内标峰面积 CS为内标浓度,液相色谱分离定量分析,c:标准曲线法
15、 -外标法,标准曲线,采集不同浓度 标样的色谱图 积分,按外标法 定量计算,建立 标准曲线,液相色谱分离定量分析,c:标准曲线法 -外标法,液相色谱分离定量分析,c:标准曲线法 -内标法,采集不同浓度 标样的色谱图 积分,按内标法 定量计算,建立 标准曲线,标准曲线,液相色谱分离定量分析,c:标准曲线法 -内标法,高效液相色谱的分析应用,氨基酸分析,氨基酸衍生化方法 柱后衍生 茚三酮方法 - UV/VIS 检测器 邻苯二甲醛（OPA）方法 - 荧光检测器 柱前衍生 异硫氰酸苯脂（PITC）方法- UV检测器,氨基酸标样色谱图,糖类分析,糖类分析（离子交换色谱） 色谱条件 色谱柱：Asahipak NH2，250 4.6mm； 进样量：20l（ppm）； 流动相：乙腈水，25乙腈50%乙腈，15 min 梯度洗脱，流速1.0ml/min； 温度：50； 检测器：ELSD（蒸发光散射检测器）,F.果糖 G.葡萄糖 L.乳糖 S.蔗糖 R.蜜三糖 St.水苏糖,应用实例,原料药纯度检测,英文文献例举及说明,通过高效液相色谱法用荧光检测分析人乳中的5-羟色胺（5-HT）浓度,5-HT含有吲哚骨架，具有固有的荧光，具有最大激发和发射波长分别为约280和340nm,*Takeshi Chiba,Tomoji Maeda,et al.Analysis of serotonin c
