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1、SNP检测技术,内容简介,SNP 概 念,等位基因和基因型 位于一对同源染色体的同一位置（基因型）上、控制相对性状的两个不同形式的基因叫等位基因。 一个基因由于突变（包括中性突变）可形成2个以上的等位基因，不同的等位基因可产生不同的遗传特征的变化，同时控制相对性状的显、隐性关系和遗传效应。如由突变形成的多种等位基因可产生多种异常表型。,正常基因称为野生型基因：具有野生型基因的细胞或个体称为野生型（wild type）。 基因突变（gene mutation）：携带突变基因的各种类型的细胞或个体称为突变体或突变型（mutant）。,一、SNP 的概念,单核苷酸多态性(Single Nucleot
2、ide Polymorphism，SNP)，指由于单个核苷酸碱基的改变而导致的核酸序列的多态性。在不同个体的同一条染色体或同一位点的核苷酸序列中，绝大多数核苷酸序列一致而只有一个碱基不同的现象，即SNP。 一般而言，SNP 是指变异频率大于1 %的单核苷酸变异。 它包括单碱基的转换, 颠换、 插入及缺失等形式,A/ G、A/ T、A/ C、C/ G、C/ T 和G/ T,转换的发生频率占多数,二、SNP在基因组内的形式:,一是遍布于基因组的大量单碱基变异; 二是分布在基因编码区(coding region) , 称其 为cSNP，属功能性突变。 SNP在单个基因或整个基因组的分布是不均匀的：
3、（1）非转录序列要多于转录序列 （2）在转录区非同义突变的频率, 比其他方式突变的频率低得多。,三、SNP 的特点,在遗传学分析中, SNP 作为一类遗传标记得以广泛 应用, 主要源于这几个特点: （1）密度高 SNP在人类基因组的平均密度估计 为 11000 bp , 在整个基因组的分布达 3106个, 遗传距离为 23cM , 密度比微卫星标记更高, 可以 在任何一个待研究基因的内部或附近提供一系列标 记。 （2）富有代表性 某些位于基因内部的SNP 有可 能直接影响蛋白质结构或表达水平, 因此, 它们可能代表疾病遗传机理中的某些作用因素。,（3）遗传稳定性 与微卫星等重复序列多态性标 记
4、相比, SNP 具有更高的遗传稳定性。 （4）易实现分析的自动化 SNP标记在人群中 只有两种等位型(allele) 。这样在检测时只需一个 “ + - ”或“全无”的方式，而无须象检测限制性片段长度多态性，微卫星那样对片段的长度作出测量，这使得基于SNP的检测分析方法易实现自动化。,四、多态性与突变的区别,1、多态性是一个群体概念，多态性指这个差异占群体的1%以上。否则就叫突变（小于1%） 2、SNP是多态性中的一种，只是进一步限定了差异只是单碱基。 3、SNP一般来说，是全部体细胞一样的基因型（除开嵌合体）。 4、突变一般不是一个个体全部细胞的变化。 5、如果突变发生在生殖细胞，则可以遗传
5、，但是只要这个突变群没有达到总群体的1%，它就只是一个突变株/系。达到了1%就是多态性了。,五、 SNPs经典检测方法,一大类是以凝胶电泳为基础的传统经典的检测方法,如: 1 . 限制性片段长度多态性法 PCR- RFLP ; 2 .单链构象多态性法 PCR- SSCP ; 3 . 变性梯度凝胶电泳 ( denaturing gradient gel eletrophoresis DGGE ); 4 .等位基因特异性 PCR ( allele specific PCR, ASPCR )等等 另一类，基因芯片、二代测序技术,（一）PCR-RFLP方法,原理：利用限制性内切酶的酶切位点的特异性，
6、用两种或两种以上的限制性内切酶作用于同一DNA片 断，如果存在SNP位点，酶切片断的长度和数量则会 出现差异，根据电泳的结果就可以判断是否SNP位 点。 特点：该技术应用的前提是SNP的位点必须含有该 限制内切酶的识别位点，它是SNP筛查中最经典的 方法之一.,PCR-RFLP原理图,（二）单链构象多态性(SSCP),原理：单链DNA 在中性条件下会形成二级结构，不同的 二级结构在电泳中会出现不同的迁移率。这种二级结构依赖 于碱基的组成，单个碱基的改变也会影响其构象，最终会导 致在凝胶上迁移速度的改变。 在非变性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链 DNA 和RNA 分 子依其单碱基序列的不同而形成不同
7、的构象，这样在凝胶上 的迁移速率不同，出现不同的条带，检测SNP。 特点：由于该方法简单快速，因而被广泛运用于未知基因突变的检测。这种方法的弊端在于不能确定突变类型和具体位置。,（三）变性梯度凝胶电泳（DGGE）,原理：是利用长度相同的双链 DNA片段解链温 度不同的原理,通过梯度变性胶将 DNA片段分开 的电泳技术。 电泳开始时,DNA 在胶中的迁移速率仅与分 子大小有关, 而一旦DNA 泳动到某一点时, 即到 达该DNA 变性浓度位置时, 使得DNA 双链开始 分开,从而大大降低了迁移速率。当迁移阻力与电 场力平衡时, DNA 片段在凝胶中基本停止迁移。 由于不同的DNA 片段的碱基组成有
8、差异, 使得其 变性条件产生差异, 从而在凝胶上形成不同的条 带。,（四）等位基因特异 PCR ( AS-PCR),原理：根据 SNP位点设计特异引物,其中一条链(特 异链)的3末端与 SNP位点的碱基互补(或相同) , 另一条链(普通链)按常规方法进行设计,因此,AS- PCR技术是一种基于SNP的PCR标记。因为特异引 物在一种基因型中有扩增产物,在另一种基因型中没 有扩增产物,用凝胶电泳就能够很容易地分辨出扩增 产物的有无,从而确定基因型的 SNP。,PCR条件优化 Taq DNA聚合酶： 1-5U/100ul,浓度过高-非特异扩增，过低-产量不足。 dNTP: 20-200mol/L,
9、四种浓度要相等，任何一种不等都会发生错配。 Mg+浓度： 0.5-2.5mmol/L,一般反应中，各种dNTP浓度为200mol/L时，Mg2+浓度为1.5-2.5mmol/L为宜，过高-非特异性，过低-酶活性降低。 引物浓度： 0.1-0.5 mol/L,过高错配、特异扩增，二聚体,模版浓度、质量 100-200ng/100ul 偏向性扩增的解决 所谓偏向性扩增是因为SNP位点上会往往存在嘌吟和嘧啶的替换，在PCR过程中，聚合反应对嘧啶(C或T)比较敏感，使得嘌吟(A或T)的扩增非常少，而出现偏向性扩增，这在SNP位点附近嘌吟含量较高时特别明显。 解决方案：（1）PCR扩增循环保持一个绝对低
10、的水平；（2）在样本中加入 0.1N NaOH使DNA变性为单链，经中和后加入全基因组扩增试剂。（3）巢式PCR-RFLP”基因分型技术,QIAGEN REPLI-g试剂盒,PCR反应出现的问题与对策 1、假阳性 出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。 引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。 靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。二是空气中的小片段核酸污染,解决方法： 操作时应
11、小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。 除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或 器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。 必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。,2、出现非特异性扩增带 PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。 原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。,对策： 必要时重新设计引物。 减低
12、酶量或调换另一来源的酶。 降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93变性，65左右退火与延伸)。,3、出现片状拖带或涂抹带 PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。 其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。 其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。 减少dNTP的浓度。 适当降低Mg2+浓度。 增加模板量，减少循环次数。,优点：这个方法是最便宜的， 不需要酶切， 一次PCR就可以得到GENOTYPING的信息。 缺点： PCR对于3端的特异性在不同退火温度时有出入， 所以退火温度的摸索很关
13、键，否则假阳性扩增是很容易的。 另外， 内参照的设置也很重要，这个东西还是很有意思的。 而且，所使用的引物位置无法人为调整，只能放在SNP的5段。,其基本原理是利用PCR引物的3端，对SNP位点附近的碱基进行人为改造，产生一个常规的限制性内切酶识别序列，如SNP rs1321425（rs1321425来自NCBI的refSNP数据库）的C/G，其任何一个碱基和上下游碱基无法形成一个可直接被限制性内切酶识别的序列，于是对SNP位点前的上游碱基进行改造，,（五）巢式PCR-RFLP技术,Nested PCR原理示意图,通过对序列的分析和PCR效果的计算，将原本四个碱基AGAT改成CTGC，结合后一
14、个碱基A 以及SNP位点G，形成CTGCAG（PstI）酶切识别位点，经测序和序列对比，改造成功。又比如rs9309462和rs4646642，成功的将2 个碱基，3个碱基进行成功的改造。rs1321425TCACAAAAAATAAAAAATTTTAATTTTAAAGGAGATA C/G ACAAGAAATGAGCATGTGTGAAAGCAC TTCTGTAAACTACATGCACTAAT,32,（六）杂交+荧光共振,分子信标（双分子间杂交） 蝎状探针（分子内杂交）,1、分子信标（Molecular beacons）,分子信标是一种新型的发卡结构的寡核苷酸探针,是在样品PCR过程中因和样品DN
15、A 杂交后而使自身荧光构象改变从而实现对SNP的检测(原理见图1) 。分子信标由称为“茎”(stem)和“环”(loop) 的两部分构成,茎部分是由寡核苷酸探针两端互补的序列形成的,又可称之为手臂,环则是探针的中间部分,其序列和待扩增的目的片段互补并含有要检测的SNP 位点。在手臂的两个末端分别通过共价的方式结合上一个荧光分子和一个荧光猝灭基团,这样当分子信标游离在溶液时,它,以发卡结构存在,荧光分子与猝灭基团在空间距离上挨在一起,十分接近,荧光分子被猝灭,此时溶液无荧光信号。相反当分子信标和其完全互补的目的片段杂交时,其发卡结构被拉开而使荧光分子和荧光猝灭基团在空间上分开从而发射出荧光,其信
16、号可提高900倍。特异性很高,相差一个碱基的目的片段都能够区分,因此用于SNP位点的检测,同时我们可以对分子信标标记以不同的荧光信号,从而能够对多个样品的同时检测。由于分子信标是在样品PCR 过程中的退火时期和目的片段特异性杂交,释放荧光,某一循环或循环后的荧光量取决于那时形成的特异的PCR 产物,因此也用于PCR 产物产量的实时检测。,36,2、蝎状探针 （Scorpion primer）,Scorpion primer 是由发卡结构(hairpin loop) 的探针部分，通过一段称为PCR stopper (or PCR blocker) 的寡核苷酸和PCR 引物的5端相连构成。 探针部分的结构和Molecular beacons 类似,由互补序列构成的“茎”和包含SNP位点且和待检测目的片段。,而PCR stopper 的作用是在PCR 过程中阻止对探针部分的扩增,避免发卡状结构在无待检测片段时通过扩增被打开而产生错误的荧光信号。 在对样品进行检测时以Scorpion primer 作为PCR扩增的
