血液分析仪检验18

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1、血液分析仪检验,自动血液分析仪（AHA）血细胞计数仪（blood cell counter） ,是临床检验最常用的筛检仪器之一 。 传统的显微镜血细胞计数或分类方法: 速度慢、误差大、影响因素多，且难以满足临床大量标本检测需求。 AHA可进行： 全血细胞计数及其相关参数的计算。白细胞分类。血细胞计数和分类的扩展功能，包括：有核红细胞计数、网织红细胞计数及其相关参数检测；幼稚粒细胞、未成熟粒细胞、造血干细胞计数；未成熟血小板比率；淋巴细胞亚型计数；细胞免疫表型检测等。,第一节 血液分析仪的检测原理 现代血液分析仪综合应用了电学和光（化）学两大原理，用以测定血液有形成分（细胞）和细胞内容物（血红蛋

2、白）。 电学检测原理包括电阻抗法和射频电导法； 光（化）学检测原理包括激光散射法和分光光度法。 激光散射法检测的对象有2类：染色的和非染色的细胞核、胞质颗粒等成分。,一、电学检测原理 1电阻抗法 即库尔特原理（图3-1）。电阻抗法是三分群血液分析仪的核心技术，可准确测出细胞（或类似颗粒）的大小和数量。,电阻抗法还与其他检测原理组合应用于五分类血液分析仪中。,图3-1 电阻抗法细胞计数原理,为提高计数准确性，部分仪器还采用3次计数、扫流和拟合曲线等技术进行血小板计数（图3-3）。电阻抗法还可用于白细胞计数及白细胞三分群分析。,例如，电阻抗法红细胞计数和血小板计数是在相应通道内进行计数，并根据二者

3、体积不同，采用浮动界标法进行区分（图3-2）。,图3-2电阻抗法正常红细胞直方图,图3-3 电阻抗法正常血小板 计数和拟合曲线直方图,2射频电导法 高频电流能通过细胞膜，用高频电磁探针渗入细胞膜脂质层，测定细胞的导电性，提供细胞内部化学成分、胞核和胞质（如比例）、颗粒成分（如大小和密度）等特征性信息。,电导性特别有助于鉴别体积相同、但内部结构 不同的细胞（或相似体积的颗粒。,图3-4 射频电流检测原理,（二）光（化）学检测原理 1激光散射法 将稀释、染色（化学染色或核酸荧光染色）、球形化的细胞悬液注入鞘液流中央，单个细胞沿着悬液和鞘液流,两股液流整齐排列，以恒定流速定向通过石英毛细管，即流体动

4、力学聚焦技术（图3-5） 。,图3-5 鞘流技术,当细胞（或颗粒）通过激光束被照射时，因其本身的特性（如体积、染色程度、细胞内容物大小及含量、细胞核密度等），可阻挡或改变激光束的方向，产生与其特征相应的各种角度的散 射光（表3-1）。放置 在石英毛细管周围不 同角度的信号检测器 （光电倍增管）可接 收特征各异的散射光 （图3-6） 。,图3-6 流式细胞术检测通道和光路系统,用于血液分析仪检测的光散射分析理论是采用Mie同质性球体光散射理论。,例如，红细胞/血小板经十二烷基硫酸钠和戊二醛固定呈球形后，采用流式细胞术激光散射法进行红细胞数量和相关参数的分析，其散点图见图3-7和图3-8。,图3-

5、7 线性化红细胞体积/ 血红蛋白浓度（V/HC）散点图,图3-8 光散射法血小板计数和红细胞计数散点图,用于血液分析仪检测的染料分为荧光染料和非荧光染料。 荧光染料有：碱性槐黄、噻唑橙、噁嗪、聚亚甲基蓝和碘化丙啶等，主 要用于核酸染色，被激 光照射后产生荧光和散 射光，如采用荧光染料 和激光散射法原理进行 的网织红细胞计数（图 3-9） 。,图3-9 噻唑橙荧光染色网织红细胞检测散点图,非荧光染料有： 亚甲基蓝（用于核酸染色） 氯唑黑E（用于单核细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞颗粒和白细胞的膜结构染色） 过氧化物酶试剂。 经过染色的细胞随鞘液流经激光检测区时，被染色部分可发生光吸收现象，使光检测

6、器接收到的散射光强度发生改变，从而区分细胞的种类。,2分光光度法 主要用于血红蛋白测定。用于血红蛋白测定的溶血剂有2大类： 改良氰化高铁血红蛋白溶血剂： 测定波长为540nm，稀释液含氰化物成分。 非氰化高铁血红蛋白溶血剂：即稀释液不含氰化物成分。如SLS-Hb法，测定波长为555nm。经HiCN法校准后，既可达到与HiCN法相当的精密度和准确性，又可避免HiCN法的试剂对检验人员的潜在危害和对环境的污染。,（三）血液分析仪检测原理的综合应用 1VCS技术 在白细胞检测通道，红细胞被溶解，白细胞接近自然状态。应用VCS技术检测白细胞大小、结构特点等（表3-2），并形成三维散点图（图3-10，图

7、3-11） 。 VCS技术检测病理性异常细胞的散点图位置见图3-12。,图3-10 体积（V）、电导（C）和光散射（S）法,图3-11 VCS细胞检测立体散点图,图3-12 VCS异常细胞检测平面散点图位置,目前，该技术也可用于网织红细胞计数（图3-13）和有核红细胞的计数。如网织红细胞计数时，采用,“透明剂”使红细胞内血红蛋白溢出形成“影细胞”，再用新亚甲蓝对网织红细胞RNA进行染色，采用VCS技术测定和分析网织红细胞。,图3-13 VCS原理新亚甲蓝染色网织红细胞散点图,2电阻抗、射频、流式细胞术和核酸荧光染色方法 （1）4DIFF通道：利用半导体激光流式细胞术、核酸荧光染色技术，采用溶血

8、剂完全溶解红细胞和血小板，白细胞膜仅部分溶解。聚亚甲基蓝核酸荧光染料进入白细胞内，,使DNA、RNA和细胞器着色。因为荧光强度与细胞内核酸含量成比例，所以未成熟粒细胞、异常细胞荧光染色深，成熟白细胞荧光染色浅，从而得到4DIFF白细胞散点图（图3-14）。,图3-14 白细胞分类4DIFF散点图,（2）WBC/BASO通道：在碱性溶血剂作用下，除嗜碱性粒细胞外的其他所有细胞均被溶解或萎缩，经流式细胞术计数，可得到WBC/嗜碱性粒细胞百分率和绝对值及WBC/BASO散点图（图3-15）。,图3-15 白细胞分类WBC/BASO散点图,（3）未成熟髓细胞信息通道：采用射频、电阻抗和特殊试剂结合法。

9、在细胞悬液中加硫化氨基酸，幼稚细胞膜脂质含量高，结合硫化氨基酸的量多于较成熟的细胞，对溶血剂有抵抗,作用。加入溶血剂后，成熟细胞被溶解，只留下幼稚细胞和异型/异常淋巴细胞（图3-16），报告百分率和绝对值，并提示核左移。,图3-16未成熟粒细胞信息通道散点图,3钨光源散射与细胞化学方法 （1）过氧化物酶染色通道：在白细胞通道加入溶血剂和POX染色剂，可计算MPXI，得到嗜酸性粒,细胞、中性粒细胞或单核细胞的相对POX活性。形成以POX分布强度为X轴、以细胞体积为Y轴的散点图（图3-17），进行白细胞计数与分类。,图3-17 白细胞（N、L、M、E）POX染色散点图,（2）嗜碱性粒细胞/核分叶性

10、通道：苯二酸完全破坏红细胞和血小板；除嗜碱性粒细胞外，其他白细胞膜溶解，胞质溢出，仅剩裸核。完整的嗜碱性粒细胞呈高角度,散射，位于散点图上部；裸核则位于下部，可进行白细胞计数和嗜碱性粒细胞计数。根据不同细胞的裸核结构进行白细胞分类计数（图3-18）。,图3-18 嗜碱性粒细胞核分叶性散点图,根据多分叶核（PMN）和单个核（MN）的比例，可计算出核左移指数（LI）。LI越高，说明核左移程度越大。目前该技术也可用于有核红细胞的计数（图3-19）。,图3-19 嗜碱性粒细胞染色/分叶核细胞通道有核红细胞散点图,（3）未染色大细胞计数（LUC）检测：在POX通道，可检测到无POX活性、体积大于正常淋巴

11、细胞体积平均值2个标准差的细胞，如异型淋巴细胞、浆细胞、毛细胞、幼稚淋巴细胞和原始细胞。,4多角度偏振光散射方法 多角度偏振光散射法（MAPSS）应用（氦氖）激光流式细胞术，分4个角度（图3-20）检测细胞（表3-3-1、图3-21、图3-22、图3-23）。嗜酸性粒细胞颗粒丰富，可消除偏振光，以此中性粒细胞相鉴别。,图3-20 多角度偏振光散射法模式图,图3-21 0前向散射光，7侧向散射光,图3-22 90垂直角度散射光（偏振光）,图3-23 90垂直角度消偏振散射光（去偏振光），90垂直角度散射光（偏振光）,鞘液中的DNA染料碘化丙啶可破坏有核红细胞膜，只留下裸核而将其染色。染料对有活性

12、的白细胞只有极小渗透性或无渗透性，故其细胞核不染色。,通过多散点图分析（MSA），可鉴别有核红细胞、无活性白细胞和脆性白细胞，计算活性白细胞比率和计数有核红细胞（图3-24）。,图3-24碘化丙啶荧光染色有核红细胞散点图,5双流体（双鞘流）技术和细胞化学染色方法 （1）嗜碱性粒细胞通道：专用染液染色，嗜碱性粒细胞具有抗酸性，染色后保持原有形态与结构，而其他细胞的胞质溢出，成为裸核。,采用电阻抗法检测，所得结果与白细胞/血红蛋白通道的白细胞（鞘流阻抗法）结果进行比较（图3-25）。,图3-25 嗜碱性粒细胞计数直方图,（2）其他白细胞分类通道：检测除嗜碱性粒细胞以外的各类白细胞。结合了钨光源流式

13、细胞光吸收、化学染色和电阻抗法（图3-26）。,DHSS采用2个鞘流装置分析细胞内部结构（图3-27）。双矩阵LIC散点图可将幼稚细胞分为3个亚群（图3-28）。,图3-26 白细胞分类计数散点图,图3-27 双鞘流图,图3-28 双矩阵巨大未成熟细胞（LIC）散点图 （IMG：未成熟粒细胞，IMM：未成熟单核细胞，IML：未成熟淋巴细胞）,四、血液分析仪检测参数及原理 不同类型血液分析仪检测参数的原理不尽相同。高档仪器应用2种或2种以上检测原理，组合电学、光学、细胞化学等技术，在独特检测通道测定红细胞、血小板和白细胞系列的数量、亚类及相关参数（表3-4、表3-5）。,第二节 血液分析仪检测参

14、数和结果显示 一、血液分析仪检测参数 血液分析仪检测参数包括：临床报告参数、异常报警或研究参数、仪器内部监测参数3类。血液分析仪检测的总体目标有2个：一是筛检和直接报告正常检验结果，二是在出现异常结果时，直接向检验人员报警。 随着检测技术的发展和临床循证检验医学证据的建立，目前用于报警和研究的参数，有可能转为能应用于临床检测的新参数。,二、血液分析仪结果显示 血液分析仪检测标本后，结果显示通常有3种形式：数据、图形和报警。 （一）数据 凡可向临床报告的检测参数，一般均以检验报告单的形式显示，可按原样和特殊格式打印，并向临床发出或传送结果。 当检测结果超出参考区间时，仪器会给予符号标记（表示增高

15、，表示降低），或用特定颜色（如红色表示增高，蓝色表示降低）加以提示。 对于无法直接报告的结果，也有相应的符号提示。有报警或结果异常的参数，经检验人员复查、确定后，方可发出报告。,（二）图形 血液分析仪常用的图形有2种：直方图和散点图。 1直方图 （1）白细胞直方图：电阻抗型血液分析仪，在35450fl范围内将白细胞分为3群。正常白细胞直方图（图3-29） 。出现异常直方图时，常伴随相应部位的报警信号，并有相应的图形改变（图3-30图3-34）。,图3-29 正常白细胞直方图及异常时曲线形态改变主要位置（R1R4）,图3-30 原始、幼稚白细胞增多直方图,图3-31 淋巴细胞减少和中性粒细胞增多

16、直方图,图3-32 淋巴细胞增多和中性粒细胞减少直方图,图3-33 中间细胞（单个核细胞）群增多直方图,图3-34 单个核细胞绝对增多直方图,（2）红细胞直方图：正常红细胞直方图（图3-2）是一条近似正态分布的单峰曲线，通常位于36360fl范围内，横坐标表示红细胞体积，纵坐标表示不同体积红细胞出现的频率。异常直方图见图3-35图-37。,图3-2正常红细胞直方图,图3-35 小红细胞且大小不均直方图,图3-36 巨红细胞且大小不均直方图,图3-37 巨幼细胞性贫血治疗有效直方图（呈双峰）,（3）血小板直方图：正常血小板直方图是一个偏态分布的单峰光滑曲线，通常在230fl范围内，主要集中在215fl。当血标本中存在大血小板、血小板聚集、小红细胞、红细胞碎片时，可出现异常血小板直方图（图3-38）。,图3-38大血小板增多直方图,2散点图 不同型号血液分析仪由于应用光散射原理不同，即使是正常红细胞、白细胞或血小板的散点图表达形式也有明显区别。通常，平面散点图只显示二维（X、Y轴）图像，