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1、项目名称：非人灵长类克隆及治疗性克隆的机理研究首席科学家：周琪 中国科学院动物研究所起止年限：2006.1至2010.12依托部门：中国科学院一、研究内容深入了解在灵长类体细胞克隆胚分化与去分化过程中基因与蛋白表达、转录调控及信号传导的分子机理是本项目拟解决的关键科学问题。本项目的研究重点包括：1. 完善动物克隆技术，尝试建立具有自主知识产权的无性繁殖技术以改进核移植流程，提高克隆效率为主，探讨建立非细胞体系的无性繁殖技术的可能性。2体细胞的去分化探索和发现卵母细胞中与体细胞去分化相关的关键蛋白、化学物质。对于启动重编程相关的关键蛋白和化学物质进行深入研究，设计调控基因表达的主要成分表，控制发
2、育进程。3维持胚胎干细胞多能性的机制研究Nanog、Oct4等转录因子的各个结构域在行使功能时发挥的作用; 以胚胎干细胞未分化的标志性转录因子Oct4及Nanog为核心，研究由其调控的下游基因及其相互关系。4胚胎的发育研究细胞核在细胞质环境中的三维结构变化，找到细胞核重编程的结构基础，研究分化是如何发生的及基因的动态表达过程，找出决定分化的基因网络。 具体回答的问题包括：1. 建立有效、经济的灵长类动物核移植方法，解决核移植效率低下的问题。2. 灵长类克隆胚在重编程过程中卵母细胞质因子的作用，找到参与体细胞核移植后重编程过程的关键蛋白质并阐明其在这一过程中所起的作用。3. 表观遗传修饰印记的消
3、除对灵长类动物克隆胚发育的影响。4. 在胚胎干细胞维持其多能性的过程中，重要转录因子的调控机制。5. 胚胎干细胞向神经干细胞发育过程中的信号通路和基因调控。6. 揭示灵长类基因组的差次表达模式和中枢神经系统发育的分子基础。主要研究内容：1. 对灵长类动物卵及早期胚胎生化特性及基因组表观遗传修饰进行研究；灵长类动物种间核移植研究；筛选、制备灵长类动物核供体细胞；建立有效、经济的灵长类动物核移植方法。2. 克隆灵长类动物；从克隆胚胎中分离胚胎干细胞并建系。3. 在胚胎基因组激活过程中，比较正常胚胎和核移植胚胎基因表达谱的差异；分析差异表达基因在核内的定位；分离在胚胎早期发育过程中起重要作用的新的转
4、录因子；研究受精卵和克隆胚在着床前胚胎发育过程中基因的表达和调控。4. 研究表观遗传修饰印记的消除对灵长类动物克隆胚发育的影响。5. 研究Nanog、Oct4等转录因子的各个结构域在行使功能时发挥的作用; 以胚胎干细胞未分化的标志性转录因子Oct4及Nanog为核心，研究由其调控的下游100个基因及其相互关系；Oct4、Nanog调控基因表达的实验研究; Oct4,Nanog在胚胎干细胞中的表达调控研究。6. 采用蛋白质组学技术研究成熟卵母细胞、激活卵母细胞、受精卵的蛋白质表达谱，用生物信息学方法构建相关蛋白质组学数据库，并通过比较这些蛋白，或者蛋白磷酸化等差异，获得其中参与细胞由分化转为未分
5、化的程中起关键作用的蛋白质，并对其蛋白表达，翻译后修饰和功能进行进一步研究。7. 研究在HGF和bFGF条件下，胚胎干细胞向神经干细胞分化的基因表达差异和HGF和bFGF引起的相应受体磷酸化。重点为HGF和bFGF与其受体结合后引起哪些位点的酪氨酸残基发生了磷酸化，以及不同浓度的HGF和bFGF引起磷酸化的强弱。8. 研究导致神经干细胞分化的信号通路。包括：HGF和bFGF引起的相应受体磷酸化的信号通路，重点研究Ras，ERK，MAPK，PI3 kinase，PLC-，STAT3，Src，RhoA-ROCK等通路对神经干细胞分化的影响；脂筏（lipid rafts）在HGF和bFGF存在的条件
6、下，对神经干细胞分化的影响。Notch和Wnt信号通路，对神经干细胞的分化的作用。9. 采用DNA芯片技术对恒河猴（Macaca mulatta）正常胚和体细胞克隆胚不同发育时期（从囊胚期、原肠胚、神经胚到大脑形成）的基因表达模式进行分析，寻找在神经系统发育过程中特征性表达的基因和基因家族；同时，比较人和恒河猴胚胎干细胞诱导分化为神经样细胞前后基因表达图谱的差异，揭示参与神经系统分化的基因和基因家族。二、预期目标总体目标:利用核移植手段获得体细胞克隆恒河猴，揭示动物克隆和治疗性克隆研究中的细胞去分化和分化的分子机制。五年预期目标:1. 建立高效的灵长类核移植方法，克隆恒河猴；从克隆胚胎中分离E
7、S细胞系；2. 揭示Nanog、Oct4等多能性转录因子的结构基础及在蛋白水平上的调控机制；并确定和克隆它们的下游因子，探讨其作用机制；3. 获得诱导体细胞重编程的关键蛋白并阐明其作用机制；4. 发现恒河猴体细胞核移植后早期胚胎发育过程中表达的重要基因及其功能和作用方式；研究遗传印记对克隆胚发育的影响；5. 了解恒河猴胚胎干细胞向神经干细胞分化的主要信号途径；6. 筛选在神经系统发育过程中特征性表达的基因和基因家族；7. 培养研究生80-100名。8. 在本领域的国际代表性学术刊物上发表60-80篇学术论文，其中影响因子高于8的不少于10篇。三、研究方案学术思路和技术途径：动物克隆效率低下的一
8、个重要原因是由于技术手段的限制而无法在研究中形成一个系统的理论，对个别影响因素、个别蛋白、个别基因的研究不足以揭示核移植胚胎这样一个复杂的生物系统的运行机制。克隆胚发育是一个由各种基因、蛋白质和其他化学分子相互作用的复杂系统的整体行为，对动物克隆和治疗性克隆的研究不仅需要认识个别的基因和蛋白质的功能，而且需要了解完整的基因组和蛋白质组的活动。本项目将细胞生物学与分子生物学、基因组学与蛋白质组学等研究方法相结合，从基因与蛋白质表达谱分析、转录调控等方面，较系统地揭示细胞分化和去分化的分子机制；解决灵长类动物克隆的难题，并促进治疗性克隆的研究和应用（见图2）。图2， 总体研究方案和课题设置图与国内
9、外同类研究相比的创新点与特色：与以往同类研究相比，本项目采用系统生物的研究策略，应用基因组学和蛋白质组学等手段，较系统地研究细胞分化和去分化的分子机制。同时，发挥我国灵长类动物的资源优势，依靠国家对灵长类研究的支持和973项目对科学前沿探索的鼓励，联合国内外相关领域优势单位的科学家，利用和整合已有的科学与技术平台，通过学科交叉、集中优势，解决动物克隆和治疗性克隆研究中的关键科学问题。可行性分析由于本项目采取了系统生物学的研究方法和手段，有望较深入地了解分化和去分化的分子机理，从而能够突破灵长类动物无法克隆的瓶颈，得到体细胞克隆的灵长类动物。目前项目主要研究人员已在提高灵长类动物体细胞克隆胚胎的
10、发育率上取得了较好进展，并且克隆胚胎能够表达关键的胚胎发育蛋白（NuMA），为本项目取得重大突破奠定了基础。课题设置课题名称负责人主要承担单位经费比例%非人灵长类克隆研究周琪中国科学院动物研究所中国科学院昆明动物所21.0非人灵长类克隆胚重编程过程早期表达重要基因的克隆及功能研究周琪JeanPaul Renard中国科学院动物研究所Unit de Biologie du Dveloppement (INRA-CNRS), Jouy en Josas, France15.5 分离和鉴定体细胞去分化关键蛋白冷静南京医科大学17.5维持胚胎干细胞全能性的机理研究裴端卿中科院广州生物医药与健康研究院1
11、7.5恒河猴胚胎干细胞向神经干细胞分化的机制研究宿兵Pierre Savatier中国科学院昆明动物研究所Inserm Unit 371Embryonic stem cells: self-renewal and early commitment (INSERM)10.5非人灵长类胚胎发育过程中基因组的程序化表达及早期中枢神经系统分化的分子机制宿兵中国科学院昆明动物研究所18.0课题1.非人灵长类克隆研究主要研究内容：1. 灵长类动物早期胚胎主要特征研究1）灵长类动物卵及克隆胚的生物学特性的研究2）灵长类动物克隆胚胎基因组甲基化研究3）灵长类动物种间核移植研究2. 核供体细胞的制备和优化1）用
12、于核移植的体细胞和胚胎干细胞的筛选和制备2）灵长类动物成纤维细胞培养方法的建立和优化3. 通过核移植证明去分化1）灵长类动物克隆2）从克隆胚胎中分离胚胎干细胞并建系目标：建立高效的灵长类核移植方法，克隆恒河猴；从克隆胚胎中分离ES细胞系课题2. 非人灵长类克隆胚重编程过程早期表达重要基因的克隆及功能研究主要研究内容：1. 胚胎基因组早期表达基因的研究 1）早期表达基因的筛选、鉴定2）早期表达基因的染色体定位2. 在胚胎早期发育过程中起关键作用的新的转录因子的研究1）新的转录子的分离2）新的转录子的鉴定及其生物学功能的研究3. 印记的消除对灵长类动物克隆胚发育的影响1）去甲基化药物的筛选2）印记
13、的消除对灵长类动物克隆胚发育的影响4. 表观遗传网络的研究目标：发现恒河猴体细胞核移植后早期胚胎发育过程中表达的重要基因及其功能和作用方式；研究遗传印记对克隆胚发育的影响课题3. 分离和鉴定体细胞去分化关键蛋白主要研究内容：1. 卵母细胞的蛋白表达谱研究1）样品采集2）蛋白表达谱及分析3）建立蛋白质组学数据库及生物信息学研究2. 重编程过程中的关键蛋白1）数据采集和分析2）筛选重编程过程中的关键蛋白3）分析这些关键蛋白在重编程过程中的作用目标：获得诱导体细胞重编程的关键蛋白并阐明其作用机制课题4. 维持胚胎干细胞全能性的机理研究主要研究内容：1. Oct4 和Nanog的结构与功能的研究 1）
14、研究Oct4和Nanog的转录激活结构域、调节结构域和蛋白相互作用结构域2）各功能性结构域与胚胎干多能性或分化的相关性研究3）筛选能够调节Oct4和Nanog表达的蛋白2. Nanog和Oct4调控的下游基因的研究1）筛选胚胎干细胞和体细胞差异表达的基因2）Oct4 和Nanog下游基因的鉴定3）克隆与胚胎干细胞多能性相关的基因3. Nanog和Oct4表达调控机制的研究1）Nanog和Oct4启动子的克隆2）鉴别在胚胎干细胞中特异性调控Nanog和Oct4表达的顺式作用元件3）寻找其他与Oct4或Nanog启动子结合的转录因子目标：揭示Nanog、Oct4等多能性转录因子的结构基础及在蛋白水
15、平上的调控机制；并确定和克隆它们的下游因子，探讨其作用机制课题5. 恒河猴胚胎干细胞向神经干细胞分化的机制研究主要研究内容：1. 恒河猴胚胎干细胞向神经干细胞分化的分子调控机制和信号通路的研究1）HGF 或 bFGF 与BMP信号在恒河猴胚胎干细胞向神经干细胞分化过程中的相互作用的研究2）HGF 或bFGF激活的下游信号通路的研究3）脂筏对神经干细胞分化的影响4）Wnt信号在神经干细胞分化过程中的作用2.鉴定对中枢神经系统发育和分化起重要作用的基因目标:了解恒河猴胚胎干细胞向神经干细胞分化的主要信号途径课题6.非人灵长类胚胎发育过程中基因组的程序化表达及早期中枢神经系统分化的分子机制主要研究内容：采用DNA芯片技术对恒河猴（Macaca mulatta）正常胚和体细胞克隆胚不同发育时期（从囊胚期、原肠胚、神经胚到大脑形成）的基因表达模式进行分析，寻找在神经系统发育过程中特征性表达的基因和基因家族
