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1、流式细胞仪的应用,主讲人：王银,流式细胞术在基础研究中的应用,细胞活力的检测 细胞周期分析 细胞凋亡分析 多药耐药基因研究（MDR） RNA测定、DNA测定 细胞内离子的测定及pH值测定,流式细胞术的临床应用,白血病免疫分型 HLA-B27: 强直性脊柱炎 淋巴细胞亚群 造血干细胞计数：造血干细胞移植 网织红细胞 PNH诊断（CD55、CD59） 血小板活化试验,guava easyCyte 8HT 微毛细管细胞分析仪 厂家：Millipore 获奖理由：突破性的微毛细管技术，无需鞘液，样品体积少，废液更少，让细胞分析变得更简单、快捷、易于操控,4,细胞活力的检测,在细胞群体中总有一些因各种原
2、因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力。,Dead Cell Discrimination,Cells should not be fixed/permeabilized prior to running on the flow cytometer. Cells are incubated on ice for 1 - 5 minutes in PI at a final concentration of 2ug/ml.,细胞周期分析,在细胞周期内DNA含量各时期发生周期性变化，通过荧光探针对细胞进行相对DNA含量测定，可分析细胞周期各时期相对的百分比，了解细胞群体的倍体性和增
3、殖能力。 DNA含量常和某种细胞周期相关蛋白同时检测，来分析细胞处于某一特定周期阶段。 恶变肿瘤细胞一般多出现异倍体，DNA含量分析对肿瘤的诊断预后有很高的价值,尤其对细胞毒性药物的研究很有价值。,G2,M,G0,G1,s,0,200,400,600,800,1000,s,DNA content,Count,G0 期细胞被认为是不参与增殖周期循环的一群细胞，即为静止细胞，其细胞DNA 含量为较恒定的2N值，G1期细胞与G0期细胞DNA值相同，均为二倍体DNA含量，当细胞进入S期后，DNA含量逐渐增加，当细胞DNA倍增结束，进入G2期，最终进入M期，在M期分裂为两个子细胞之前，G2和M期细胞的D
4、NA含量均为恒定的4N值，即为四倍体细胞群。,G0-G1,S,G2-M,Fluorescence Intensity,# of Events,A typical DNA Histogram of cell proliferation,样品制备,1000rpm 5分钟 收集2X106个细胞,PBS漂洗 两次,70%酒精 4度固定过夜,收集固定的细胞,PBS漂洗,0.5ml PBS 悬浮细胞,2.5l 10g/l RNase A,37度消化1小时,过300目细胞筛,50l 0.1mg/ml PI（含1%Triton),1000rpm 5分钟 离心,两次,混匀，室温 静止5分钟,上机,经RNA酶处理
5、前后的比较,RNA也是核酸，也会被PI染色，为避免干扰,染色前需用RNAse降解RNA。这样PI只染DNA，能精确以荧光强度反映DNA的含量。,结果解读 G0/G1期细胞占总的61.2%，峰位于横座标的45.76 G2/M期占13.07，峰位于横座标的91.43 S期占25.73 G2/G1为2.0（即G2期为4倍体细胞，而G1期为2倍体细胞，比值为2） 峰的变异系数为4.54%（好） 细胞碎片为0.48%，细胞聚集体有0.06%。 总的细胞数（仪器检测到的）为17525个， 在细胞周期中分析的细胞数为17431个（即排除了碎片及聚集体后） CV是变异系数。一般CV越小，峰形越好，越尖锐。能控
6、制在5%左右是比较好的结果，一般小于10%就可以认可了。,应用DNA含量测定鉴定细胞凋亡,如果有凋亡，在G0/G1期前面有个凋亡峰(也称sub-G0期) 在凋亡细胞中，用PI染色，通过流式检测DNA含量，可以发现一种亚群的细胞，其染色荧光强度下降。这是由于随着调亡的进行，核酸内切酶活化，随后一部分DNA泄漏出去，造成细胞内DNA含量下降造成的。,Flow Cytometry of Apoptotic Cells,缺乏IL-3诱导的细胞凋亡,在DNA直方图上区分凋亡峰和细胞碎片峰,上图为细胞碎片峰，在二倍体G0/1峰之前呈左高右低的抛物线（蓝色）,上图为细胞凋亡峰，在二倍体G0/1峰之前呈对称分
7、布的抛物线（蓝色）,流式细胞术在生殖医学中的应用,精子细胞和精子为单倍体细胞1C ; 次级精母细胞为二倍体细胞2C; 初级精母细胞和处于G2M期的精原细胞4C,细胞凋亡分析,细胞凋亡,特点：染色质的浓缩, 核膜及细胞膜的内陷, 接着核碎裂成分离的片段,凋亡小体(apoptosis body)的出现。 在流式细胞仪上，对于光散射特性观察凋亡细胞的改变：由于细胞的固缩，体积变小，FSC会变小，而细胞碎片及颗粒增多，SSC也会改变。,在细胞凋亡过程中细胞形态学的变化,早早期凋亡的检测-capase3 早期凋亡Annexin-V-FITC/PI双染法 早期凋亡线粒体细胞膜电位的检测 晚期凋亡- “TU
8、NEL”法 晚晚期凋亡-DNA含量分析法,caspase-3,Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中 caspase-3 为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活， 活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。,Massive substrate cleavage,Apoptosis Signaling,Receptor,Flow
9、 Cytometric Analysis of Apoptosis in Jurkat T Cells,Relative Cell Number,Active Caspase-3FITC,0 0.5 1 2 4,Incubation with Camptothecin喜树碱 (hr),早早期凋亡的检测capase3 早期凋亡Annexin-V-FITC/PI双染法 早期凋亡线粒体细胞膜电位的检测 晚期凋亡- “TUNEL”法 晚晚期凋亡-DNA含量分析法,Annexin-V-FITC/PI双染法,正常细胞膜磷脂的分布是不对称的，膜内表面含有带负电的磷脂（如磷脂酰丝氨酸，PS），而膜外表面含有占
10、绝大多数的中性磷脂。 在细胞凋亡早期，细胞表面发生变化，细胞膜内部的PS迁移到细胞外层表面。Annexin V是一种对Ca2+依赖，对PS有高度亲和力的磷脂结合蛋白，可作为探针识别细胞膜表面是否有PS，从而识别凋亡细胞。,Annexin V Assay,细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻染色体局部凝聚,Annexin-V-FITC/PI双染法,由于坏死细胞也可能在细胞膜表面出现磷脂酰丝氨酸，又在细胞凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其初期。细胞膜有损伤的细胞DNA可被PI着染而产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号，正常活细胞
11、与此相似。 在流式细胞术双参数散点图上左下象限显示活细胞，为（Annexin V-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为Annexin V+/PI+；而右下象限为凋亡细胞，显现Annexin V +/PI-。,Annexin V Assay 区分死亡与凋亡,Annexin V-PI Analysis,Camptothecin:喜树碱，抗肿瘤药物,实验步骤,1.离心收集悬浮细胞，微量离心机转速2000RPM，离心时间5min，弃培养基。 2. 用冷PBS洗涤细胞两次。 3.用400ul 1X Binding Buffer悬浮细胞，浓度大约为1 X 106 cells/ml。 4.在细胞悬
12、浮液中加入5ul Annexin V-FITC，轻轻混匀后于2-8C避光条件下孵育15分钟。 5.加入10ul PI后轻轻混匀，于2-8C避光条件下孵育5分钟。 6. 在1小时内用流式细胞仪或荧光显微镜检测。,早早期凋亡的检测capase3 早期凋亡Annexin-V-FITC/PI双染法 早期凋亡线粒体细胞膜电位的检测 晚期凋亡- “TUNEL”法 晚晚期凋亡-DNA含量分析法,原 理,细胞凋亡与坏死在形态特征上有明显的区别，根据细胞凋亡和坏死的形态特点，一般认为在细胞坏死早期就会出现细胞膜通透性及线粒体跨膜电位的改变，而在细胞凋亡时这些改变的发生则要晚。一旦线粒体跨膜电位崩溃，则细胞凋亡不
13、可逆转。,凯基细胞凋亡线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1） （JC-1 Apoptosis Detection Kit）,采用一种阳离子脂质荧光染料JC-1作为检测线粒体跨膜电位指示剂。 JC-1有单体和多聚体两种存在状态，在低浓度时以单体的形式存在，高浓度时以多聚体形式存在，两者的发射光谱不同，单体在流式细胞仪绿色（FL-1）通道检测出绿色荧光，多聚体在流式细胞仪红色（FL-2）通道检测出红色荧光。 JC-1可透过正常细胞膜以单体状态聚集胞内，正常健康线粒体的膜电位（y）具有极性，JC-1依赖于y的极性被迅速摄入线粒体内，并因浓度增高而在线粒体内形成多聚体，发射红色荧光。而细胞发生凋亡时，线粒
14、体跨膜电位被去极化，JC-1从线粒体内释放，红光强度减弱，以单体的形式存在于胞质内发绿色荧光。根椐这一特征检测线粒体膜电位的变化。,凋亡诱导剂诱导P388细胞凋亡，利用凯基细胞凋亡线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）进行检测，通过流式细胞仪分析分析结果。正常细胞FL-1亮,FL-2亮; R1，凋亡细胞 FL-1亮, FL-2暗; R2,R1,R2,R3,R4,R1,R2,R3,R4,早早期凋亡的检测capase3 早期凋亡Annexin-V-FITC/PI双染法 早期凋亡线粒体细胞膜电位的检测 晚期凋亡- “TUNEL”法 晚晚期凋亡-DNA含量分析法,原 理,细胞凋亡时，核酸内切酶活化，双链D
15、NA 会出现许多不对称的断裂点，即产生一系列3-OH的末端。外源性荧光标记的脱氧核苷酸末端转移酶（terminal deoxynucleotidyl tranferase, TdT）能够催化外源性荧光素或酶标记的dUTP连接到DNA的3-OH末端，用流式细胞术检测。,BrdUrd Incorporation,BrdU作为一种胸腺嘧啶核苷的类似物像胸腺嘧啶核苷一样可掺入到细胞合成的DNA中。当细胞处于DNA合成期而同时又有BrdU存在时, 就会有BrdU掺入新合成的DNA中，只要细胞不消亡，这种BrdU就在胞核的DNA中长期存留。掺入到DNA的BrdU可通过抗BrdU单克隆抗体显示。 该方法能对
16、细胞周期进行迅速而稳定的测量, 而且标记BrdU的细胞只要不受到紫外线照射，对细胞本身没有功能损害。 该技术可应用到跟踪检测移植细胞的存活、分化和功能状态。,（5-Bromo-2-deoxyUridine,5-溴脱氧尿嘧啶核苷),Br-dUTP,Br-dUTP比生物素/荧光素标记的脱氧核苷酸磷酸盐复合物、地高辛更容易掺入到凋亡细胞的DNA中。因为Br-dUTP有很强的掺入能力，所以在用荧光素标记的抗BrdU单克隆抗体来检测时，会得到更好的流式细胞信号。 未凋亡的细胞因为没有暴露的3未端，所以不会被检测。,TUNEL Assay,TUNEL Assay,早早期凋亡的检测capase3 早期凋亡Annexin-V-FITC/PI双染法 早期凋亡线粒体细胞膜电位的检测 晚期凋亡- “TUNEL”法
