光学显微镜基础知识

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1、奥林巴斯生物显微镜,光学显微镜基础知识,显微镜的光学原理 象差 显微镜的技术参数 显微镜的光学部件,基础知识,显微镜成像,F,F,物镜,显微镜成像,物镜,显微镜成像,物镜,明视距离,基础知识,光学显微镜基础知识,显微镜的光学原理 像差 显微镜的技术参数 显微镜的光学部件,理想成像,点,标本,投影图像,点,平面,平面,图形,准确 相似 图形,像差,实际图形,点,标本,投影图像,虚的圆,平面,弯曲的面,图形,变形的图形,像差,象差的种类,球差 象散 慧差 畸变 场曲 色差,基础知识,象 差,球差,象散,慧差,场曲,负畸变,正畸变,基础知识,场 曲,基础知识,基础知识,ACH,PLAN ACH,场曲

2、, ,色 差,基础知识,色差校正,对照,色差校对,无校对,校对,基础知识,光学显微镜基础知识,显微镜的光学原理 像差 显微镜的技术参数 显微镜的光学部件,显微镜的技术参数,数值孔径 分辨率 工作距离 焦深 放大倍率 同焦距 同轴度,基础知识,数值孔径(N.A),基础知识,分辨率,基础知识,R = k /NA ：波长 NA：数值孔径,K常数: K光镜 = 0.61；KFV = 0.51,数值孔径大分辨率高,基础知识,NA与焦深,基础知识,工作距离(W.D),基础知识,工作距离,不需要盖玻片 有盖玻片,同焦距（齐焦距离),基础知识,同轴度,基础知识,比如10倍物镜下的中心,转换到40倍是仍然几乎是

3、中心,柯勒照明和临界照明,基础知识,临界照明 柯勒照明,基础知识,厚标本和薄标本,4 - 5 um,2um,基础知识,基础知识,光学显微镜基础知识,显微镜的光学原理 像差 显微镜的技术参数 显微镜的光学部件,显微镜的主要光学部件,物镜 目镜 聚光镜,基础知识,物 镜,基础知识,物镜的种类,按色差和场曲校正程度分: 消色差物镜（Ach) 平场消色差物镜(PlanAch) 平场半复消色差物镜(Plan-FL或PLFL） 平场复消色差物镜（PlanApo) 平场超级复消色差物镜（PlanSApo),基础知识,VIS NIR范围内优异的色差校正,UPLSAPO物镜,消色差 Ach 蓝 (486nm)

4、和红 (657nm) 半复消色差Fluorite 兰和红 + (绿, 紫色(437nm) 复消色差Apo 437-657nm 超级复消色差Super Apo 430-1000nm,物镜的色差校正,轴向色差,侧向色差,ACH,消色差 Ach 蓝 (486nm) 和红 (657nm) 半复消色差Fluorite 兰和红 + (绿, 紫色(437nm) 复消色差Apo 437-657nm 超级复消色差Super Apo 430-1000nm,物镜的色差校正,轴向色差,侧向色差,ACH,FL,消色差 Ach 蓝 (486nm) 和红 (657nm) 半复消色差Fluorite 兰和红 + (绿, 紫色

5、(437nm) 复消色差Apo 437-657nm 超级复消色差Super Apo 430-1000nm,物镜的色差校正,轴向色差,侧向色差,ACH,FL,Apo,消色差 Ach 蓝 (486nm) 和红 (657nm)；绿球差 半复消色差Fluorite 兰和红 + (绿, 紫色(437nm)；绿、兰球差 复消色差Apo 437-657nm ，绿、兰、深兰球差 超级复消色差 430-1000nm Super Apo,物镜的色差校正,轴向色差,侧向色差,ACH,FL,S Apo,Apo,消色差物镜,基础知识,复消色差物镜,半复消色差物镜,传统物镜的符号,基础知识,新物镜的符号,基础知识,其它物

6、镜,基础知识,浮雕相称物镜,无应力偏光物镜,相称物镜,超低倍物镜,带校正环物镜,基础知识,对载波片和盖玻片厚度的要求,载玻片: 0.9 - 1.4 mm 盖玻片: 0.17 mm,无盖片物镜,基础知识,物镜光阑的运用,光阑全开启,光阑适当关小,荧光观察中应用,目 镜,基础知识,目镜的视场,基础知识,F.N.22,标本的视场直径,标本的视场直径 = 目镜视场数 / 物镜倍率 例: WH10X目镜视场数为22 物镜为UPLFL40X 视场直径 = 22 40 = 0.55mm,基础知识,聚光镜,显微镜的调节,瞳距调节 屈光度调节 光路转换 聚光镜中心 孔径光栏设置,瞳距调节,屈光度调节,调节,光路

7、转换,100%,80%,20%,100%,聚光镜中心调节, 光轴中心调节螺钉, 视场光阑, 孔径光阑,10X物镜, 标本, 聚光镜升降旋钮,孔径光栏调节,N.A聚=(0.6-0.8)N.A物,孔径光栏开度与图象,100%,70%,30%,HR LC,HC LR,MR MC,孔径光栏的运用,孔径光栏的运用,对比度调节,奥林巴斯显微镜无限远光学系统UIS,显微镜无限远光学系统UIS,有限远,无限远 UIS,光学系统,Merit of the Infinity system,UIS 系统,Universal Infinity System 万能无限远系统 1. 完美结合分辨率和对比度 -明场高分辨率

8、 -高对比度、高亮度图像 -清晰的 DIC图像 -更敏感的偏光观察 -清晰、色彩明亮的相衬,UIS 系统,Universal Infinity System 2. 系统灵活性 - 无限远校正光学系统 - 物镜和结像透镜完全校正 3. 物镜万能性更强 -A single universal objective lens performs very well in Fluorescence, Nomarski DIC, Phase contrast, Polarized light and, of course, Brightfield -High UV transmission, Strain-

9、free, Perfect correction of Chromatic aberration and other optical aberrations,Competition comparison,F : Fully Primary Correction in objective & tube lens Tc : Tube-lens Compensation,奥林巴斯显微镜无限远光学系统UIS,增加附件，光路不变，倍率不变，F.N.不变 中间附件设计更简单，不需增加透镜 物镜单独完成象差校正，象差校正更高，不需目镜补偿 更高镜像亮度，荧光效果更好（结象透镜校正） 接视频效果更好，不需增加

10、照相目镜,相差观察方式,1 原理 利用被检物体的光程（折射率 x 厚度）差进行镜检，即利用干涉现象，将相位差变为人眼可以分辨的振幅差,共轭面：吸收光线，直射光通过,补偿面：相位推迟，衍射光通过,物镜相板,聚光镜环状光阑,相差观察方式,2 特点 鉴定活体细胞最实用、最经济的方法 3 缺点 需要光强高 切片不能太厚(210um) 盖片、载片需符合标准 最好配用单色滤光镜 操作较麻烦 荧光效果不如明场物镜,相差观察方式,4 应用： 无色透明活体标本的细微结构，检查,鉴定活体细胞(培养细胞,分离细胞),相差观察方式,5 调节： 柯勒照明调节 将相差物镜及附件转入光路（物镜聚光镜相衬环型号匹配） 对样品

11、聚焦 取下目镜，装上CT望远镜， 调节CT焦距看到清晰的相差环 调节聚光镜上定位螺丝，使环状光阑象与相板共轭面重合,荧光观察方法,什么是荧光 ?,物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光，是非温度辐射光冷光。即：物质吸收短波光，发射出的长波光。 显微镜荧光利用光源激发光化荧光,荧光显微镜的作用原理,宽谱线发射光（汞灯）,滤掉其他光，透过激发光,激发滤色片,吸收滤色片,滤掉激发光，透过荧光,标本受激发产生荧光向四周发散,激发光受反射、折射或衍射向四周发散,荧光的性质,吸收光，必需有激发光源 荧光波长激发波长（损失热能） 荧光强度极小于激发光的强度 有不同程度的

12、衰减 荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率,荧光显微镜的优点和用途,优点： 检出能力高（放大作用） 对细胞的刺激小（可以活体染色） 能进行多重染色 用途： 物体构造的观察荧光素 荧光的有无、色调比较进行物质判别抗体荧光等 发荧光量的测定对物质定性、定量分析,荧光显微镜的主要部件,透射式 吸收滤色镜 暗场聚光镜 激发滤色镜 汞灯光源,落射式 吸收滤色镜 分光镜 激发滤色镜 汞灯光源,落射荧光显微镜的构造,吸收滤色镜,激发滤色镜,落射荧光显微镜的构造,荧光显微镜光源,汞灯光源: 提供激发光(U、V、B、G),氙灯光源： 高峰值更宽，更稳定,荧光显微镜激发透镜组,激发滤色镜: 激发波长选择

13、,激发透镜组 （激发块）:,T%,nm,BAND PASS,入射光,发射光,激发 滤色镜,分光 滤色镜,吸收 滤色镜,落射荧光显微镜各部件特性和作用,吸收滤色镜: 荧光透过,阻挡杂光,分色镜: 反射激发光,荧光透过,A 透过,A,A 反射,B,B 透过,B 阻挡,nm,nm,T%,T%,A,滤色镜的选择,荧光素的特性,滤色镜的特性,激发,分色,吸收,带宽对图象的影响,SWB: BP420-480,WB: BP450-480,WIB: BP460-490,NB: BP470-490,FITC+PI,双重染色标本的单色和双色观察,WU,WIB,DUAL BAND,WIBA,WIG,WIB,DAPI+FITC,FITC+PI,单色滤色镜的特性曲线,现行显微镜特点和各种滤色镜,油镜应使用荧光油,物镜光栏的运用,光栏全开启,光栏适当关小,减少杂散光干扰,汞灯灯箱构造,灯室，上下、左右旋钮，聚光镜旋钮,谢谢！,