《阿霉素对k562细胞gfi1表达的影响及其与相关凋亡基因关系的研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《阿霉素对k562细胞gfi1表达的影响及其与相关凋亡基因关系的研究（12页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果阿霉素对K562细胞Gfi1表达的影响及其与相关凋亡基因关系的研究 作者：常伟孙汉英黄敏周剑锋 张义成 【摘要】 本 研究 探讨阿霉素体外作用于K562细胞的细胞效应及癌基因Gfi1和相关凋亡基因表达变化的机制。用不同浓度的阿霉素作用于K562细胞24小时,然后 应用 DNA电泳和流式细胞术检测K562细胞凋亡;用RTPCR、流式细胞术检测Gfi1、Bcl2、bax 基因和蛋白表达的变化。结果表明：当阿霉素浓度在0、 mg/L作用K56细胞24小时,细胞凋亡增加
2、,可见典型的DNA断裂电泳条带;同时,当ADM浓度自增为 mg/L时, Gfi1表达减少,bax表达增加;Bcl2表达在ADM mg/L之间变化不明显,mRNA及蛋白水平均无统计学差异；当阿霉素浓度大于 mg/L时,细胞凋亡率并不增加,而是下降,且出现细胞坏死。结论：一定浓度阿霉素能诱导K56细胞凋亡,细胞凋亡率表达的变化与阿霉素浓度呈一定的量效依赖关系, 阿霉素诱导K56细胞凋亡可能与抑制Gfi1基因的表达和激活bax 基因的表达有一定的关系。 【关键词】 阿霉素 K56细胞； 细胞凋亡；Gfi1； Bcl ； bax Effect of Adriamycin on Gfi1 Express
3、ion in K56Cells and Its Relationship with the Relevant Apoptotic Genes Abstract The study was purposed to explore the effect of adriamycin (ADM) on K56cells in vitro and the mechanism of expression changes of relevant apoptotic genes and oncogene Gfi1.The apoptosis was assayed by flow cytometry (FCM
4、) and the DNA electrophoresis; the expression changes of Gfi1、Bcl2、bax mRNA and protEin were detected by RTPCR and FCM after K56cells were treated with different concentrations of ADM forhours. The results showed that when K56cells were treated with mg/L ADM forhours, the typical apoptotic DNA elect
5、rophoresis band of K56cells were observed with the dose increasing. When concentration of ADM was mg/L, the expression of Gfi1 decreased and the expression of bax increased; when concentration of ADM was mg/L, the expression of Bclwas not found to be significantly changed, the levels of BclmRNA and
6、protEIn were of no statistical difference. When dose of ADM was higher mg/L, the percentage of apoptotic K56cells decreased with cell necrosis. It is concluded that at certain range of concentration, apoptosis or necrosis of K56cells can be induced by ADM, the percentage of apoptosis, the changes of
7、 expression of Bcl2, bax and Gfi1 depend on the dose of ADM. The mechanism of apoptosis in K56cells induced by ADM may be related to suppression of Gfi1 oncogene and activation of expression of bax gene. Key words ADM; K562; apoptosis; Gfi1; Bcl2; bax J Exp Hematol007; 15(2):278-282 阿霉素在细胞凋亡中起着重要的作用
8、,国内外有不少学者利用阿霉素成功地诱导了细胞凋亡，但对其作用机制还不完全清楚。为此,我们利用阿霉素诱导急性髓系白血病细胞株K562细胞凋亡,旨在了解阿霉素对细胞凋亡的作用机制,为今后临床血液系统肿瘤的 治疗 提供 理论 的依据。 材料和 方法 试剂和细胞系 K562细胞由我院免疫学教研室提供,胎牛血清为杭州四季青公司产品, 阿霉素购自意大利Pharmacia 公司,RPMI 1640 购于美国Gibco公司, 碘化丙锭(PI)购于北京中山生物工程公司。AnnexinV/PI试剂盒购自北京宝赛生物工程公司。RTPCR试剂盒购自华美公司。羊抗多克隆Gfi1、羊抗多克隆Bcl2、鼠抗单克隆bax购自
9、美国Santa Cruz公司。兔抗羊及兔抗鼠FITC标记二抗购自北京中山生物工程公司。 中国 实验血液学杂志 J Exp Hematol007; 15(2)阿霉素对K562细胞Gfi1表达的 影响 及其与相关凋亡基因的研究细胞培养 K56细胞培养于含有10%的胎牛血清的RPMI 1640 液中,在含% CO2饱和湿度的培养箱中常规传代培养。每2天进行半量传代。取对数期生长细胞,调整K56细胞浓度至105/ml,接种于6孔的培养板,每孔加入2 ml细胞液,然后分别加入阿霉素的终浓度为0,及 mg/L，每个浓度取3个平行孔。每次实验重复3次。 DNA提取及电泳 以0 mg/L为对照组，/L、.0
10、mg/L的阿霉素作用于K562细胞2小时后, 收集细胞1106, 常规方法提取DNA , 溶于200 l 1TE。取1l 样品1%琼脂糖凝胶电泳约50分钟, EB染色, 紫外灯下观察并照相。 细胞凋亡的FCM检测 采用AnnexinVFITC/PI双染法FCM检测，方法参照试剂盒说明书进行。取上述终浓度处理细胞2小时,分别收集10以上的细胞于离心管中,用PBS 充分洗涤,沉淀，加100 l binding buffer,重悬细胞，然后加入AnnexinV l和PI l,避光30分钟;再加400 l binding buffer,上FCM 分析 。 Gfi1、Bcl 、Bax 蛋白水平变化的FC
11、M检测 以0 mg/L为对照组，、.0 mg/L的阿霉素作用于K562细胞2小时后, 收集细胞1106，75%乙醇固定细胞48小时，%Triton100破膜，Gfi1和Bcl2、bax抗体37避光孵育60分钟， FITC标记二抗37避光孵育60分钟，上机检测，分别用无关IgG作一抗对照; PBS+二抗作二抗对照。 Gfi1、Bcl 、bax 基因表达水平的RTPCR检测 以、 mg/L 阿霉素作用于K56细胞2小时，按TRIZOL试剂盒的使用说明提取各自总的RNA,用AMV逆转录试剂盒合成cDNA，在20 l总反应体系中含l总RNA，42孵育1小时，65灭活5分钟, -20保存。引物根据 软件
12、设计,由博亚生物公司合成： Gfi1：sense:5GCAAGGCATTCAGCCAGAG， antisense:5AAGGCAAAGGAGGAGCAA3，Tm=55,产物30bp；Bcl2：senseTCTGGGAATCGATCTGGA ，antisenseATCTCCCGGTTATCGTA3，产物30bp, Tm=44；bax：sense:5GGCTGGACATTGGACTT3，antisense5CCCGAAGGAGGTTTATT3，产物53bp, Tm=46；actin：sense:5 CTCACGAAACTGGAATAAGC 3， antisense:5 AAGCCACACGTACT
13、AAAGGT 3 , Tm=55，产物180 bp。按RT PCR 试剂盒在PCR 仪上扩增,其循环参数为50，30 分钟，95，15分钟,激活耐热DNA 聚合酶, 进行逆转录成cDNA; PCR反应参数为945秒, Tm 5秒,725秒,32个循环,最后72 10分钟;获得产物用1.%琼脂糖凝胶电泳。 RTPCR结果用Quantscan软件进行半定量灰度扫描分析。在各样本之间灰度值与actin灰度值比值相比较。 统计学分析 实验数据以均数标准差表示,所有数据采用SPSS 医学统计学软件处理。组间差异比较按单因素方差分析F检验。 结 果 DNA凝胶电泳 .0 mg/L的阿霉素可使K562细胞出
14、现典型的DNA 电泳条带, 即DNA ladder, 断裂的DNA 片段约为180 bp或其整数倍。而/L的阿霉素作用后K562细胞则无此DNA 断裂现象。 Figure 1. DNA electrophoresis pattern of K56cells after treatment with different concentrations of ADM forhours. Lane 1: DNA marker. Lane: control( 0 mg/L). Lane: /L. Lane:.0 mg/L. 不同浓度阿霉素对K562细胞凋亡的作用 mg/L阿霉素处理K562细胞24小时细
15、胞凋亡增加, mg/L时凋亡率最高。当大于 mg/L时,细胞凋亡率反而降低。 Figure. Apoptosis of K56cells after treatment with different concentrations of ADM forhours. A：control. B:.0 mg/L. Table 1. Apoptosis rate of K56cells after treatment with different concentrations of ADM forhours ( %, SD) Concentration (mg/ L)Apoptosis *P Gfi1 、Bcl2、bax基因表达在阿霉素处理前后的变化 用/L ,.0 mg/L
