发育神经生物学概论(简本)

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1、发育神经生物学 简介,组织学与胚胎学教研室,文建国,神经生物学所用的研究方法,神经系统发育的基本阶段,发育的基因调控,细胞迁移的控制机制,神经细胞最后表型的形成,讲 授 提 纲,概 述,概 述,发育神经生物学是神经生物学的一个研究分支，是神经科学领域中一门新兴的，综合的基础实验科学。 神经系统的发育过程，包括细胞间的识别与基因表达，神经通路的寻找与建立，神经细胞的衰老与防衰老，以及发育的可塑性等。 探寻先天性畸形、肿瘤的发生与神经发育异常的相关性，等等。,含义,研究,应用,特 点,强调两个“相互作用”： 基因与环境：神经系统的发育是基因表达和环境因素交互作用的结果； 神经元与神经胶质细胞：神经

2、系统的发育是神经元与神经胶质细胞相互作用的结果。,基因调节,基因表达,1、细胞培养技术 2、分子标记技术 3、反义技术 4、转基因技术,一、神经生物学所用的研究方法,通过实验控制和影响发育过程，能对发育事件进行精确的时间顺序分析。 可克服血脑屏障与体内各种因素的影响，研究某个神经组织区域。 可对发育中的神经系统进行细致的生化分析。,1、细胞培养技术,优点：,神经细胞培养技术类型,外植体细胞培养(explant cell culture)； 分离的细胞培养(dissociated cell culture)； 重新聚合的细胞培养(reaggregate cell culture)； 克隆细胞培养

3、(clonal cell culture)。 前三类合称原代培养，第四类是对单一细胞的后代谱系进行培养。这四类技术各有其优点，都对发育神经生物学有着独特的贡献。,2、分子标记技术,发育系统的研究存在许多难点，细胞谱系多、发育阶段转换快、胚胎细胞缺乏。故难以对细胞类型进行精确定性和定位。 随着免疫学的发展，对每种细胞进行多克隆或单克隆抗体标记 ，可鉴定特异性细胞群。,核苷酸标记探针可检测出特异性的核苷酸顺序及mRNA，与免疫细胞化学法结合，可以分析与细胞表型有关的基因表达过程。 利用逆转录病毒载体（retrovirus vector construct）,也可将一个异种标记基因引导至处于某个发育

4、阶段的细胞。,3、反义技术,应用反义分子（反义DNA或RNA）干预目标基因的表达，使mRNA前体剪接和翻译受阻，达到封闭或阻断特异基因表达的目的。 技术手段简洁，构思精巧，有效可靠。不需改变基因结构就可分析基因的功能，从而避免对基因进行条件性突变，且不影响靶基因的邻近基因的正常表达。,将体外合成的反义RNA注入早期胚胎，观察基因表达受抑时表型的改变； 以受条件启动子启动的反义表达载体转染培养的组织细胞； 将反义基因整合于种系细胞以在个体水平上分析基因的功能。 上述方法可有助于研究结构基因的功能、基因的表达调控、细胞分化的遗传控制、程编性死亡的机理、基因表达的时序关系等神经生物学的重大问题。,反

5、义技术的三种方法：,4、转基因技术,生殖工程与遗传工程结合的一种技术方法。 原理：将目的基因（外源基因）在体外改造构建成可表达的融合基因后，将其导入受精卵或囊胚期的全能干细胞内，使目的基因在染色体上稳定整合。然后将受精卵或囊胚移入假孕母体子宫，使之发育成为能把目的基因传给子代的个体。 用此技术培养出的动物称转基因动物。,转基因技术的方法有：,畸胎瘤细胞植入法 逆转录病毒转染法 显微注射法 胚胎干细胞法 该技术可利用建立的转基因动物模型，检测癌基因，转录特定基因，研究结构蛋白和功能蛋白基因胚胎发育中的作用，为基因治疗等提供了新的思路。,1、神经诱导与神经外胚层的形成 2、定位性细胞繁殖 3、细胞

6、迁移 4、细胞类聚 5、未成熟神经元的分化 6、特异性联系的形成 7、程序性细胞死亡 8、神经联系的第二次调整,二、神经系统发育的基本阶段,细胞增殖 ( cell reproduction )； 细胞分化 ( cell differentiation )； 形态发生 ( morphogenesis )。 神经系统从较简单的结构发育成极为复杂的结构网络，是以高度有序的时间与空间顺序贯穿于整个胚胎发育的全过程。大致经过了以下八个阶段：,胚胎神经系统发育的 三个方面与八个阶段：,三个方面,八个阶段,1、神经诱导与神经外胚层的形成,含义：中、外胚层相互作用诱导出神经外胚层。 原理：中胚层释放：神经化因

7、子，使神经组织特化；中胚层化因子，其浓度梯度，决定着脑的区域分化。 结果：中胚层从头端到尾端依次诱导前脑、中脑、后脑、脊髓。,2、定位性细胞繁殖 （locallized cell proliferation）, 神经管形成，细胞迅速繁殖 神经板凹陷形成神经管时，细胞数量变化不大； 一旦神经管闭合，管壁的单层上皮迅速增殖为假复层神经上皮，继而增殖为复层上皮。, 脑区内细胞数量决定于： 繁殖期的长短； 有丝分裂周期的长短； 神经前体细胞数量的多少。,细胞的生日 细胞丧失合成DNA的能力、停止有丝分裂的时间，称为细胞的生日，它是细胞生活史中的关键阶段。 细胞的生日严格不变。知道某种细胞的生日，就能知

8、道其最终在何部位定居，甚至可知道某些神经元与其它神经元的联系形式。,体积较大（包括突起很长）的细胞，出生较早；较小（包括突起较短的） 的细胞出生较晚； 对各脑区来说，细胞层次与繁殖顺序有关。如大脑皮质最深层的细胞出生最早，最浅层的细胞出生最晚； 在多数脑区内，第一批胶质细胞与神经元出现时间相同，但胶质细胞繁殖期持续得较长，甚至终生都可由干细胞繁殖。,细胞出生的三条规律,3、细胞迁移（cell migration）,多数神经元产生于或靠近于神经管室带，但最终定居部位却离管室带有一定距离，这就必须发生细胞迁移。 迁移方式：多呈阿米巴样运动。迁移细胞先伸出一个引导突，细胞本身附着在适宜的底物上，并将

9、胞核注入引导突，最后，细胞核后方的尾随突撤回。,图2 放射状胶质细胞所起的“脚手架”作用 放射状胶质细胞突起跨架神经管整个管壁厚度，神经元沿突起爬行，右侧为局部放大。,4、细胞类聚 (cell sorting),神经元到达最终定居部位后，同类细胞既互相识别，又互相粘附，使同类细胞按一定方向和位置聚合在一起，以便形成特定的结构形态。,5. 未成熟神经元的分化,神经元突起的细致加工； 神经纤维寻找路途； 神经纤维集束化； 神经化学特异性方式的选择。,6、特异性联系的形成,神经元之间的精确联系，如神经回路的建立； 神经元的区域特异性、联系部位特异性、化学特异性的建立； 突触的形成和调控机制的建立等。

10、 发育的早期阶段，上述联系大多已建立完成。这与神经元和神经胶质细胞之间的识别与粘附密切相关。,7、程序性细胞死亡,正常发育过程中，特定的神经元在特定的时间自然淘汰性死亡。 一般取决于神经元是否与靶组织及时建立关联。 发育早期，神经元发生的数目过剩，当神经元细胞数量与支配的靶组织大小相适应后，没有找到靶细胞的多余的神经元最终在特定的时间淘汰死亡。 死亡机制与神经细胞竞争靶组织细胞内的营养物质（如神经营养因子）有关。,8、神经联系的第二次调整,表现为起初建立的某些神经联系的撤出与另一些神经联系的稳定过程。 此次调整，不是神经元数目的调整，而是神经元突起数目的精细重调。 调整的机理与程序性死亡类似。

11、,图8-3 神经纤维与靶的匹配 神经纤维竞争靶组织内有限的神经营养物质，通过匹配调整，部分神经纤维存活，其它纤维则以自然死亡形式淘汰。,神经系统发育的基本阶段,神经外胚层形成,定位性细胞繁殖,细胞迁移,细胞类聚,未成熟神经元分化,特异性联系形成,程序型细胞死亡,联系的第2次调整,强 调,神经系统的发育贯穿于生命的大部分时间。 神经发生及神经回路建立的活动主要发生在胚胎时期，但也持续到出生后的早期； 神经元发育及其功能特性在整个生命过程中均能表现，无论是在正常条件下或是对损伤与衰老的反应中都能表现出来。,1逐级控制的层次网络 2发育调控基因的多次表达 3. 其它因素对神经系统发育的影响,三、发育

12、的基因调控,1逐级控制的层次网络,整个发育过程在层次网络控制下进行； 层次网络由发育调控基因组成； 这些基因呈现阶段性表达。,四种水平的基因对NS发生的调控,原神经基因：赋予早期发育中的外胚层细胞成为神经前体细胞的潜能； 神经生成基因：决定其中哪些细胞成为神经前体细胞； 神经类型选择基因：决定神经前体细胞的类别； 细胞谱系基因：决定神经前体细胞后代的类别。,2发育调控基因的多次表达,现已发现： 一个发育调控基因可以在完全不同的几个发育途径中反复使用，分别参与不同的控制系统。,3. 其它因素对神经系统发育的影响, 癌基因-大多作为调节基因，控制发育的开关，以激活相应基因的表达，通过其表达的产物进

13、而控制神经细胞的增殖和分化。 生长因子-通过与细胞膜上相应受体结合，触发细胞周期中相关生化过程，导致细胞的一系列活动。, 粘附分子（adhesion molecule, AM）,是一类介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质间粘附作用的膜表面糖蛋白。 种类繁多，包括选择素家族，整合素家族，免疫球蛋白超家族，钙依赖粘附素家族等。,作用：调节细胞的粘连特性、决定细胞的形态、控制细胞的生长和分化、调节细胞运动等方面影响神经发育。,AM对神经发育的具体作用可能包括：,神经细胞粘附分子（NCAM）参与： 轴突生长迁移的胶质细胞引导机制； 参与神经突起纤维束化过程； 参与轴突与靶细胞的交互作用； 参与细胞位置关系

14、的建立与稳定过程； 神经元-胶质细胞粘附分子（NgCAM）参与： 神经元与神经胶质细胞间的多种结合过程。,细胞间粘附分子 （intercellular adhesion molecules，ICAMs）,围绕神经元的细胞外基板的成分，包括层粘连蛋白（LM）和纤维粘连蛋白（FM）等。 参与细胞迁移和神经纤维长出过程。作用机制包括： LM能将细胞表面与其它基质糖蛋白连结在一起； FM与发育神经组织的细胞之间、细胞与基质之间的粘连，参与发育细胞的运动和细胞间的聚合与分化过程。 FN对神经嵴细胞的分化和迁移亦有影响。,1、细胞迁移与迁移方向的控制机制 2、迁移信号 神经细胞粘附分子（NCAM） 细胞外

15、基质（ECM） 其它信号分子,四、细胞迁移的控制机制,1、细胞迁移与迁移方向的控制机制,单个的运动,群体的运动,近距离运动,远距离运动,细胞先伸出一个突起，附着于底物上；接着通过细胞骨架系统，将整个神经细胞牵拉到突起附着点。 控制迁移的方式：沿着胶质细胞形成的“脚手架”爬行；受多种化学因子局部浓度梯度的指引，跨过多细胞的区域。,形式：,过程：,控制：,2、迁移信号,一种膜糖蛋白分子，结合有唾液酸。其唾液酸和多肽链因发育阶段和发育部位而异，从而导致对神经元的不同影响。 在细胞迁移前的胚胎早期和细胞分化定居后的晚期阶段，含唾液酸多，粘着力弱，有利于细胞迁移和突起生长；如唾液酸减少，则粘着力增强，具

16、有稳定细胞聚集和限制细胞迁移的作用。, 神经细胞粘附分子（NCAM）, 细胞外基质（ECM）,细胞外基质中，大分子种类繁多，包括胶原蛋白，纤维连接蛋白，层粘连蛋白，蛋白聚糖及透明质酸等。 几乎所有的细胞外基质成分都参与了细胞迁移过程的调节； 调节方式：可能是通过多种成分浓度梯度的变化来实现的，如神经嵴细胞的迁移过程。, 其它信号分子,表皮生长因子（EGF），神经生长因子（NGF），神经元抗原L1等的参与。 EGF可增加透明质酸的释放和蛋白聚糖的产生，从而控制细胞迁移过程； NGF与神经元抗原L1则可增加小脑颗粒细胞迁移后附着的稳定性。,1、生长锥（growth cone） 2、神经元和胶质细胞的交互作用 施万细胞（schwan cell, SC） 星形胶质细胞： 3、细胞内机制 4、神经纤维生长与通路寻找假说 标记通路假说 引导标细胞假说 粘连或亲合梯度假说 外周公