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1、第3节 微生物数量的测定,1.记住统计菌落数目、土壤取样及稀释的方法。 2.能运用从土壤中分离特定微生物及进行平板计数的方法。,微生物的数量是一个非常重要的卫生指标,在做食品和饮用水的卫生学检查时,必须测定其中的细菌总数和大肠菌群数。 测定土壤中微生物的数量 1.原理 平板菌落计数法是将待测定的微生物样品按比例作一系列稀释后,将其中的微生物充分分散成单个细胞,吸取一定量某几个稀释度的菌液接种到平板上,培养一段时间后,每个单细胞生长繁殖形成单个菌落,根据稀释倍数、取样接种量和菌落数即可换算出样品的含菌数。,2.方法步骤 (1)制备尿素固体培养基 (2)制备土壤样品稀释液 (3)加样 (4)倒平板
2、 (5)培养 (6)统计菌落数 (7)计算样品中的菌数 3.注意事项 统计菌落时,一般选择在同一稀释度的3个培养皿中的菌落数目相近者,并且要求菌落数目在一定的范围内。若测定细菌和放线菌,要求每皿以30300个菌落为宜,若是霉菌则以每皿10100个菌落为宜。,1.显微镜直接计数法与平板菌落计数法的比较 (1)显微镜直接计数法 原理:利用血球计数板在显微镜下直接计数,是一种常用的微生物计数方法。 过程:将经过适当稀释的菌悬液渗入血球计数板的计数室中,在显微镜下进行计数。由于计数室的容积是一定的,所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来换算成单位体积内的微生物总数目。由于此法计得的是活菌和死菌的总
3、和,故又称为总菌计数法。 优点:直观、快速。 缺点:需要与血球计数板配套使用,且计数随机性大,所以不能作出较为宏观、全面地反映菌体数量的结果。不能区分活菌和死菌。,(2)平板菌落计数法(间接计数法) 原理:当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个菌落只来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数,就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确,一般选择菌落数在30300的平板进行计数。 计算公式:每克样品中的菌数 C:代表某一稀释度下平板上生长菌落的平均数; V:代表加入每一平板的稀释菌液体积; m:代表稀释倍数。 优点:能测出样品中的活菌数,因此又称活菌计数法。 缺点:操作过
4、程较烦琐,时间较长,测定值常受各种因素影响。,2.平板菌落计数法注意事项 (1)设置对照 目的:排除实验中非实验因素对实验结果的影响,提高实验结果的可信度。 方法:取一个未接种的培养基与接种好的培养基在相同条件下培养。 (2)注意无菌操作 建立无菌观念,严格控制实验器材、实验室、实验操作者的消毒和灭菌。 整个实验过程必须保证无菌操作。 取样、稀释都要在酒精灯火焰附近的无菌环境中进行。 规范操作,防止其他微生物污染,实验结束后洗手消毒。 (3)准确计数 统计结果时,按照不同微生物选择不同的稀释倍数。 要设置3个或3个以上的重复组,然后求其平均值。,题型一,题型二,测定细菌数量的原理与方法 【例题
5、1】 用平板菌落计数法测定同一土壤样品中的细菌数,在对应稀释度为10-6的培养皿中, 得到以下几种统计结果。正确的是( ) A.接种了1个平板,统计的菌落数是230 B.接种了2个平板,统计的菌落数是216和260,取平均值238 C.接种了3个平板,统计的菌落数分别是21,212和256,取平均值163 D.接种了3个平板,统计的菌落数分别是210,240和250,取平均值233,题型一,题型二,解析:在设计实验时,一定要接种至少3个平板作为重复组,才能增强实验的说服力与准确性,所以A、B两项不正确。C项虽接种了3个平板, 但是,其中一个平板的计数结果与另两个相差太远,说明在操作过程中可能出
6、现了错误,因此,不能简单地用3个平板的计数值求平均值。 答案:D 反思领悟在设计实验时,一定要接种至少3个平板作为重复组;在分析实验结果时,一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致,如果结果差别过大,则意味着操作有误,需重新进行实验。,题型一,题型二,平板菌落计数法的注意事项 【例题2】 用平板菌落计数法来统计样品中活菌的数目。在某稀释浓度下,某同学做了若干个平板并统计每个平板的菌落数,最接近样品中菌体数真实值的是( ) A.菌落数量最多的平板 B.菌落数量最少的平板 C.菌落数量适中的平板 D.取若干个平板菌落数量的平均值 解析:用平板菌落计数法对样品中活菌数目进行统计,只是一种估测。根据此方
7、法的实验过程可知,在某一稀释度下平板上生长的菌落数具有一定的偶然性,并不是绝对均匀,所以取若干个平板菌落数量的平均值比较接近样品中菌体数的真实值。 答案:D,题型一,题型二,反思领悟由于有的菌落不止是由一个细菌生长而成,可能是由两个或多个细菌繁殖形成,所以计数出的样品的菌数会与样品的实际菌数有偏差,即计算出的样品的菌数往往比活菌的实际数目低。,1,2,3,4,1.下列关于从土壤中分离细菌的操作步骤,正确的顺序是 ( ) 土壤取样 称取10 g土壤,加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中 吸取0.1 mL待测样进行平板涂布 制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7不同
8、稀释度的稀释液 A. B. C. D. 答案:C,1,2,3,4,2.用平板菌落计数法来统计样品中的活菌数时,通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数。原因是 ( ) A.平板上的一个菌落就是一个细菌 B.菌落中的细菌数是固定的 C.此时的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌 D.此方法统计的菌落数一定与活菌的实际数相同 答案:C 解析:用平板菌落计数法来统计样品中的活菌数时,平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌,但偶尔也能来自两个或多个细菌,所以此方法统计的菌落数可能与活菌的实际数不相同。,1,2,3,4,3.下列关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述,错误的是( )
9、 A.用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基,经高温、高压灭菌后待用 B.取10-4、10-5、10-6稀释度的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL,分别接种于各组平板上 C.将实验组和对照组平板倒置,37 恒温培养48 h D.确定对照组无菌后,选择菌落数在300以上的实验组平板进行计数 答案:D 解析:检测土壤中细菌总数时,用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基,经高温、高压灭菌后待用,取10-4、10-5、10-6稀释度的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL,分别接种于各组平板上,倒入冷却好的培养基并混匀,凝固后将实验组和对照组平板倒置,37 恒温培养48 h,在确认对照组无菌后,选择菌落数在30300的一组平板为代表进行计数。,1,2,3,4,4.用平板菌落计数法来统计样品中活菌的数目,其结果与实际值相比( ) A.比实际值高 B.比实际值低 C.和实际值一致 D.比实际值可能高也可能低 答案:B 解析:培养基上的一个菌落可能由相连的两个或多个菌体繁殖而来,因此统计的活菌数可能少于菌体实际值。,
