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1、从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果用大鼠原代心肌细胞构建工程化心肌组织的研究 作者：常海霞，郑强荪,刘兴光 【摘要】 目的 探索用大鼠原代心肌细胞构建工程化心肌组织的 方法 。方法 用胶原、Matrigel、2倍DMEM分别与含%EDTA的%胰酶制备的乳鼠原代心肌细胞和%胰酶制备的原代心肌细胞混合，注入环形槽内形成心肌条带，一周后行力学拉伸继续培养一周。常规HE染色等对组织工程化心肌组织，即心肌条带进行评价。结果 心肌条带出现自发性跳动，HE染色显示与正常成年大鼠心肌组织类似，电镜结果显示条带中
2、的心肌细胞含有丰富的肌原纤维,肌小节结构和Z带清晰可见。用含%EDTA的%胰酶制备的原代乳鼠心肌细胞构建的心肌条带，拉伸后第4天形成一致性跳动。免疫组化检测提示肌钙蛋白阳性细胞数多于对照组。电镜观察显示，条带的心肌细胞中肌原纤维较对照组明显增多。结论 这一方法可构建工程化心肌组织，心肌细胞制备方法的改进以及液态型胶原浓度的精确测定，可显著提高构建心肌条带的成功率及条带的生理功能，使其更接近正常心肌组织。 【关键词】 原代心肌细胞;液态型胶原;工程化心肌组织 基金项目： 全军医学科研“十五”计划项目自主 Experimental Study of Engineered Heart Tissue
3、Using Neonatal Rat Primary Cardiomyocytes Abstract: OBJECTIVE To construct engineered heart tissue (EHT) using neonatal rat primary Liquid collagen type I, Matrigel andDMEM were mixed with neonatal rat cardiac myocytes isolated using % trypsin including % EDTA,or % trypsin only as a control. The mix
4、ture was then pippetted into circular molds to construct cardiac ring. days later, the cardiac ring was subjected to 10 % static stretch for another days. microscopy and transmission electron microscopy, routine HE staining and immunohistochemical staining were used to analyze the Spontaneous beatin
5、g was seen in the EHTs. HE staining revealed that cardiac myocytes within the EHTs resembled that of the native adult cardiac tissue in morphology. Transmission electron microscopy revealed that the cardiac myocytes within the EHTs contained abundant myofibrils, clearly defined sarcomeres and Z line
6、s. The EHTs constructed using the cardiac myocytes isolated by % trypsin supplemented with % EDTA finally came to synchronous beating at the fourth day of stretching. Histological and immunohistochemical analysis also showed more positive cardiac myocytes and more myofibrils per cell than in the con
7、trol The method described in this study is helpful in constructing tissue engineered heart tissue. The improved technique for cardiac myocyte isolation and accurate quantification of liquid collagen type I are beneficial to EHTs construction and the EHTs are likely to share more structural and funct
8、ional similarities with that of similar to the native heart tissue. Key words：Primary cardiac myocyte; Liquid collagen type I; Engineered heart tissue(EHT) 本实验旨在对在体外构建和重现心脏组织的方法进行探索，寻找能够构建类似正常心肌组织的方法，这一方法XX年德国的 科学 家Zimmermann等人的 研究 中首次使用1-3，军事医学科学院赵云山等对其进行了改进4，在此基础上我们对构建的方法做了进一步改进，并对 影响 因素进行了 总结 ，对所
9、涉及的传统方法做了改良和细化。 1 材料与方法 材料 试剂 DMEM(美国Sigma公司),胎牛血清(北京元亨圣马生物技术研究所),胰酶(美国Sigma公司),基质蛋白(Matrigel,美国Sigma公司),生物核素标记的羊抗小鼠试剂盒(中山试剂公司),DAB显色试剂盒(中山试剂公司)，肌钙蛋白T。 动物 新生SD乳鼠,由第四军医大学动物中心提供。 仪器及装置 相差显微镜，CO2培养箱,铸模装置(自制),动态拉伸装置(自制)。 方法 型胶原浓度的测定 胶原溶液的制备见 文献 5。取1 ml加在经称量过的质量相同的十张纸上，编号记录数据，另取相同质量的十张纸同时放入120的恒温箱中烘干2h，取
10、出立即称取各纸的质量并记录， 计算 烘烤前后未加胶原的纸的质量差，每一纸的差值除以该纸未烘烤前的质量，为该纸单位质量烘烤后失重，求平均值，所得为单位质量纸在烘烤中所失量。用该平均值乘以加胶原纸在烘烤前的质量，为该纸本身在烘烤后所失质量。求出加胶原的纸烘烤前后的重量差值，再减去纸本身所失质量即为1 ml胶原溶液中胶原的质量，求平均值，即为胶原的浓度。浓度在/ml均可，本试验制备的胶原为 mg/ml。 心肌细胞的分离 新生12d的SD乳鼠于75%酒精中浸泡处死，无菌条件下取心脏,PBS清洗，剪成1 mm1 mm1 mm大小。实验组加入适量含%EDTA的%胰酶，吹打静置后取上清，入血清中终止消化，剩
11、余组织重复操作至完全消化。1000 rpm离心min，弃上清，加入培养液，于5%CO2、37培养箱中,培养1h(差速贴壁),收集液体，离心弃上清后所得细胞主要是心肌细胞。大多数文献中认为%的胰酶制备心肌细胞比较理想5，故本实验中选用该浓度为对照组。收集的心室组织块中加入%的胰酶置于37水浴中消化min取上清,入血清终止消化。剩余组织重复以上操作,直到组织消化完全。之后同实验组。各组取等量细胞行二维培养。 组织工程化心肌条带的制备 液态型胶原与2DMEM等比例混合,用 mol/L NaOH调定至中性,再加入10%的Matrigel。将终浓度为4107/ml分离的心肌细胞与上述混合物混合,加入环形
12、槽中，总量1ml，胶原 mg，其它成分的量按比例换算。置5%CO2、37培养箱中。混合物凝固后，加含20%血清的DMEM培养液。1 d后，可见心肌条带有明显的回缩，去除外围琼脂，加入上述培养液，5%CO2、37培养箱中培养7天。制备实验组40个心肌条带，对照组40个心肌条带,其中各组有10条不加Matrigel。 力学刺激方式 心肌条带培养7d后,套在动态拉伸装置上,调整间距,使在静止时条带处于 自然 状态的最大间距，拉伸频率为60次/分,继续培养7d。 组织工程化心肌条带检测 方法 心肌条带培养1d后,行各种检查，具体方法如下:(1)大体观察:肉眼及光镜观察条带在培养期间跳动情况。(2)免疫
13、组织化学染色:样品经包埋,石蜡切片,脱蜡,复水，抗原修复，%TritonX-100、%H2O2的甲醇溶液孵育10 min，冲洗，封闭血清作用1min，弃血清,加一抗:肌钙蛋白T,4过夜。PBS漂洗20 min,加二抗,37孵育1min;PBS漂洗20 min,辣根标记的链霉卵白素作用1min。PBS漂洗20 min,DAB显色,水洗10 min，透明,封片。(3)透射电镜观察:3%的戊二醛固定标本,包埋切片,透射电镜观察。 统计学处理 计数资料以百分率表示，采用X2检验：P 2 结 果 .1 肉眼及光镜观察 实验组制备的心肌细胞在二维培养中，活力非常好，立体感强，成纤维细胞增殖不明显。对照组的
14、心肌细胞由于成纤维细胞的大量增殖，第3天细胞变得很难观察。实验组构建的心肌条带培养第4天出现局部的节律性搏动，在拉伸后第4天形成肉眼可见的一致跳动。对照组的心肌条带培养第6天后出现散在的跳动点，拉伸后第6天出现肉眼可见一致跳动。没有加Matrigel的20个心肌条带在培养的第3天之后出现过度回缩。 .2 免疫组织化学染色观察 条带中细胞分布均匀,沿拉伸方向伸展,胞核长梭形，实验组的肌钙蛋白阳性细胞数较对照组的肌钙蛋白阳性细胞数明显多，细胞排列较整齐，沿拉伸方向的细胞比例多于对照组(图1A,1B,1C)。 .3电镜观察 电镜观察显示,条带中心肌细胞含有排列整齐的肌原纤维,并沿着细胞的长轴方向伸展
15、,肌小节结构和Z带清晰可见,但是在实验组(图2A)中肌原纤维的数量较对照组(图2B)明显多，而且整齐，有横管结构，形成的肌小节较对照组接近正常心肌细胞。 3 讨 论 有三个主要因素 影响 构建心肌条带的成功率：1）细胞活力，这是最至关重要的；2）支架材料的选择和添加量;3）细胞外因子的作用。 传统方法消化心肌需要在37水浴中长时间震荡5-8，我们提高胰酶浓度至的基础上加EDTA，可大大缩减消化时间，不需水浴震荡。在二维培养中用胰酶加EDTA制备的心肌细胞明显优于胰酶制备的心肌细胞，制备的心肌细胞活力佳，立体感强，对成纤维细胞有明显的竞争性抑制作用，限制其过度生长，可以推测这种心肌细胞主动纯化过程使其本身有了更多的营养供给和生存空间，从而发育的更完全更成熟。电镜的结果显示用实验组构建的心肌条带中，心肌细胞的肌原纤维的数量较对照组明显多，形成的肌小节也明显较对照组接近正常心肌细胞。这些结果说明胰酶加EDTA这样的消化酶浓度更适合于心肌细胞的制备，它可以大大缩短消化酶对心肌细胞的破坏时间，也就在一定程度上保护了心肌细胞，使其正常生理状态下的活力得以保持，从而具备了与成纤维细胞竞争营养
