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1、Approaches and Techniques in Research on Tumor A course for Ph.D. candidates,肿瘤的实验动物和细胞研究技术,The animal model and in vitro research of tumor,常用研究方式： In Vitro: 体外研究，细胞、组织培养下进行 In Vivo: 体内研究，人类疾病的动物模型 Ex Vivo: 细胞经体外实验处理后，再回输到体内 体外处理：转染基因或改变环境(用一些因子) 使其分化等,体外研究(In Vitro ) 原代培养肿瘤细胞: 从肿瘤组织中分离得到的细胞在体外成功地进行
2、 培养称为原代培养(primary culture) 肿瘤细胞系:原代培养肿瘤细胞能连续传代（约710天传代一次） 半年以上,生长稳定, 并能保持肿瘤细胞的特性， 称为肿瘤细胞系(cell line) 肿瘤细胞株:细胞系经细胞克隆或其它方法获得具有某种生物学特性 的纯谱系的细胞称为肿瘤细胞株(cell strain), 细胞具有 相同的基因型和表型(单克隆),肿瘤细胞株的建立： 1、 直接从人的肿瘤或动物的自发及诱发肿瘤组织分离培养 建系和建株; (从自发或诱发瘤) 2、从人或动物的移植肿瘤(如人肿瘤裸鼠移植瘤)组织分离 培养建系及建株; (从移植瘤) 3、用化学或生物(病毒)方法在体外转化正
3、常的人或动物的 细胞株而获得肿瘤细胞株。(体外转化),肿瘤细胞株的鉴定： 1. 有关的原始资料,包括供瘤病人的姓名、年龄、性别、病历号、 临床诊断（TNM）、活检病理诊断,手术切除日期、最后病理诊断等 2.形态学观察: 普通倒置相差光镜:活细胞的形态, 细胞间桥,分泌颗粒,重叠生长, Giemsa染色或H.E.染色的光镜 形态与肿瘤细胞的生长条件有一定关系: HeLa: 高浓度血清长梭形; 低浓度血清圆形细胞,排列如鹅卵石路面; 透射和扫描电镜 3D组织结构,3. 核型及染色体观察: 整倍体,异倍体,染色体畸变、标记染色体,染色体分带分析, 相隔一定时间重复观察数次 4.生长特性: 分裂指数（
4、3H-thymidine或5-BrdU的labeling index）、 生长曲线、 细胞群体倍增时间、 集落形成或贴壁率（plating efficiency） 半固体培养介质中的集落形成率 5.组织特性的鉴定: 免疫细胞化学方法,上皮性肿瘤标志: CK、上皮膜抗原（EMA）、 癌胚抗原（CEA）; 淋巴瘤抗原标志: 人白细胞分化抗原簇（CD）,有274个以上, T淋巴细胞: UCHL-1(CD45RO), B淋巴细胞: L26（CD20）, 软组织肿瘤标志：波形蛋白（Vm） 肌源性：结蛋白（Dm）、肌动蛋白、肌凝蛋白、肌红蛋白 神经源性： 神经微丝（NF）、S-100蛋白、 Leu-7、
5、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、髓磷脂碱性蛋白(MBP) 组织细胞源性： -1抗胰蛋白酶、 -1抗糜蛋白酶、CD68 血管源性：八因子相关抗原、CD34、荆豆凝集素(UL) 基膜源性：纤连蛋白（FN）和层粘连蛋白（LN） 体外培养时肿瘤细胞株有可能会失去原本表达的某些组织抗原,抗原标志要多选用几种抗体,以减少假阴性结果;,6. 其他特性： (a) 分泌激素和异位激素: 绒毛膜癌HCG 垂体瘤生长激素 肺燕麦细胞癌和一些甲状腺癌ACTH 人肺巨细胞癌细胞株（PLA-801）促性腺激素 肝癌HCG (b) 肿瘤细胞的受体表达: ER PR AR (c) 酶及同工酶活性: 酶活性保持(HTC酪氨酸氨
6、基转移酶)、变化 诱导剂 糖皮质激素、多肽激素 改变培养条件：谷氨酸替代谷氨酰胺脑星形胶质细胞谷氨酰合成酶 活性增7倍左右 特异的同工酶谱： 绒癌T3M-3表达胎盘性碱性磷酸酶,(d) 癌基因及抑癌基因核酸及蛋白的表达： 高转移人卵巢细胞系HO-8910PM 表达：p53 p16 bcl-2 nm-23 CD44v6 c-erbB-2 EGFR 等基因的蛋白产物 不表达：Bax基因的蛋白产物,7. 细胞株交叉污染的检测： 细胞遗传学方法： 染色体分析 特异的染色体标志探针作FISH G带核型分析鉴别同种肿瘤细胞 Q带分析检测人Y染色体 免疫学方法：HLA或动物的组织相容性抗原的测定 生化方法：
7、同工酶谱或其它生化指标,8. 微生物污染的检测： 细菌：培液混浊，高倍镜下隐约可见均匀散在细小菌体 真菌：培液混浊，高倍镜下可见菌丝或孢子 病毒：病毒核酸和蛋白产物 支原体：以核酸（DNA）荧光染色即H-stain(Hoechst 33258， 即二苯并咪唑染色)较为常用, 356nm光的激发下 可发出458nm的强荧光,体外正常细胞恶性转化的鉴定 正常细胞体外恶性转化的鉴定指标(14项指标) （第二届全国细胞和组织培养专题讨论会通过） 核型分析出现非整倍体 能在软琼脂培养基中增殖并形成集落 异种动物接种能生成肿瘤 端粒保持不变或延长以及端粒酶活性的增高,指标 正常细胞 转化的纤维母细胞 转化
8、的上皮细胞 形态 伸展良好,折光较弱;核质比小, 梭形,伸展较差,折光较强;核质比大, 与正常细胞之间差别不如纤维母细胞 胞质嗜碱性弱;核仁较小较少; 胞质嗜碱性强,核仁较大较多;多核巨细胞 大;多形性较常见 多核巨细胞较少 较多 粘附性 细胞间粘附性较强,紧贴瓶壁生长 粘附性差,易脱落 差别不明显 生长特性 排列有方向性,单层生长,存在密度 方向性消失,多层重叠,密度依赖性抑制消失 差别不明显,某些细胞株呈重叠生长 依赖性抑制 对血清的依赖 较高 较低 差别不明显 扫描电镜观察 微绒毛少 微绒毛丰富 微绒毛不稳定,有时增多 植物凝集素引起的凝集 弱 较弱 较强 细胞表面的糖蛋白和糖脂 正常
9、糖基化不完全 糖基化不完全 纤维连接蛋白 正常存在 减少或消失 纤溶酶原激活酶 较低 增高 不稳定,某些株增高 胞质中微丝微管的排列 规则 紊乱 不稳定 胞质cAMP浓度 较高 较低 核型 二倍体 非整倍体或假二倍体 非整倍体 琼脂培养 不生长 生长 生长 接种异种易感动物 不长肿瘤 长肿瘤 长肿瘤,世界各国的细胞库（cell bank）及索引 美国 美国典型培养细胞库（American Type Culture Collection, 即ATCC, Rockville,MD） 人与动物细胞培养目录（Catalog of Human and OtherAnimal Cell Cultures,
10、 Naval Biosciences Laboratory, Cell Culture Department, Naval Supply Center, Oakland,CA) 人基因突变细胞及老年细胞培养库（Human Genetic Mutant Cell Culture and Ageing Cell, Culture Repositories, Institute for Medical Research, Camden, NJ) 欧洲 真核细胞培养库(Culture de Cellules Eucaryotes, Repertoire des Utilisateurs., M. Ad
11、ophe, D. Gourdji, A.Tixier-Vidal, R. Robineaux, Inserm Publications,101 Rue de Tobiac,75654 Paris, Cedex 13 医学病毒学系（Department of Medical Virology,Institute de Pasteur, Paris) 欧洲动物细胞培养库（European Collection for Animal Cell Cultures,即ECACC, PHLS/CAMR, Porton, Salisbury, England) 欧洲人类基因突变细胞库(European Hu
12、man GeneticMutant Cell Bank, Department of Clinical Genetics, Erasmus University, Rotterdam) 日本 癌细胞系库(Collection of Cancer Cell lines, National Institute of Hygenic Sciences, Tokyo) 普通细胞库( General Cell Bank, Institute of Physical and Chemical Research of RIKEN, Saitama) Flow Laboratories; GIBCO,特殊表型
13、肿瘤细胞系（株）： 高转移 人肝细胞性肝癌细胞株MHCC97 人黑色素瘤细胞株MV3、 卵巢癌细胞株HO-8910PM、 肺巨细胞癌细胞株PGBE1 高度耐药 人红白血病细胞株K562/ADM对阿霉素的抗性增114.7倍 分泌产生激素、蛋白、酶或一些因子 人肺小细胞癌细胞株LU-165抗利尿激素; 人肺腺癌细胞株LC-2/ad1-抗胰蛋白酶 人红白血病细胞株K562高表达端粒酶,体内研究(In Vivo) 肿瘤动物模型： 自发性肿瘤 诱发性肿瘤 移植性肿瘤.,一、自发性肿瘤 种系：大鼠的自发肿瘤不如小鼠多见，大动物更为少见 Sinclair猪到一岁时有85%可发生恶性黑色素瘤 品系： C3H小鼠 乳腺癌发病率为97% BALB/c 乳腺癌发病率低 AKR小鼠 淋巴细胞性白血病发病率为70%90% 近交系SJL/J小鼠 淋巴瘤(何杰金病)自发率高达91% 缺点：发病迟,发病时期不集中,发病率也不稳定,二、诱发性肿瘤 优点：发生率、发病时间、发生部位及组织学类型均易控制 实验结果重复性相对较好 1.化学诱癌动物肿瘤模型 1775年英国医师Pott 扫烟囱 阴囊癌 1914年,日本学者山极和市川 煤焦油 皮肤癌 1934年Yashida用邻氨基偶氮甲苯诱发大鼠肝癌成
