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1、从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果浅析新基因NOR1对肝癌细胞系HepG2蛋白质表达谱的影响 【摘要】 目的: 研究NOR1基因对肝癌细胞系HepG2蛋白质表达谱的影响。方法: 将(+)/ NOR1的表达质粒经脂质体导入HepG细胞, Northern blot筛选出阳性克隆, 通过双向电泳分离过表达NOR1的HepG2细胞内蛋白质, 筛选出差异表达的蛋白质点, 并进行质谱分析鉴定。结果: 鉴定出6种表达上调的蛋白质点, 包括锌指蛋白、 肿瘤坏死因子受体、 酪氨酸蛋白磷酸化受体等, 这些蛋白质涉
2、及基因转录、 信号转导等肿瘤发生相关事件。结论: NOR1基因可能通过上调这些蛋白参与多种途径影响肝癌的发生发展。 【关键词】 NOR1基因 双向电泳 基质辅助激光解吸飞行时间质谱 硝基还原酶基因NOR1是课题组克隆的一个与亚硝胺类化合物致癌密切相关的新基因1, GenBank登录号为AF。人体多组织Northern blot表达分析显示NOR1基因在所检测的肝、 脑、 肾、 肺、 脾脏、 骨骼肌等12种正常组织中广泛表达, 且有2个转录本(1600 bp, 1200 bp)2。通过构建NOR1基因真核表达载体及NOR1基因转染HepG2肝癌细胞系, 发现NOR1基因转染可引起IL8的表达升高
3、3,。为了深入研究NOR1基因功能, 本试验运用转基因技术构建过表达NOR1基因肝癌细胞系HepG2, 采用高通量的蛋白质组技术研究过表达NOR1肝癌细胞系HepG2后蛋白质表达谱的改变, 通过对差异蛋白点的鉴定与分析, 探讨NOR1基因在肝癌发生、 发展中的作用。 1 材料和方法 材料 人肝癌细胞系HepG2细胞由中南大学湘雅三医院检验科保存; (+)载体为哺乳动物高效表达载体, 为Invitrogen公司的产品; (+)/NOR1载体由中南大学湘雅三医院检验科构建; 随机引物标记盒购自美国Promega公司; TRIzolTM试剂购自美国Gibcol/BRL公司; 蛋白质相对分子质量(Mr
4、)标准购自中科院上海生物化学研究所; 同位素32pdCTP、 33pdATP, 购自北京福瑞公司; 引物由大连宝生物有限公司合成; 固相pH梯度干胶条、 载体两性电解质、 IPG缓冲液、 覆盖液、 石蜡油、 银染试剂盒、 IPGphor电泳单元及双向电泳附件、 EPS500电源、 重泡胀附件和循环水浴箱等电聚焦系统、 IPGPhor电泳系统等购自Pharmacia公司; 丙烯酰胺、 亚甲基双丙烯酰胺为国产分析纯; 乙腈为国产色谱纯; 其他试剂为国产分析纯试剂; 垂直平板电泳系统、 循环水浴箱购自BioRad公司; PDQUESTD胶分析系统购自BioRad 公司。 方法 (+)/NOR1/He
5、pG2稳定表达系的建立 方法详见文献3。上游引物为5ATG ACT TCC AAG CTG GCC GTG GCT3, 下游引物为5TCT CAG CCC TCT TTC AAA AAC TTC TC3; 为了进一步验证稳定细胞系的建立, 我们还使用Northern blot方法进行了验证, 方法见分子克隆操作。 蛋白抽提与定量 细胞培养至对数生长期, 弃出培养液, 用胰酶消化, PBS洗后约2106细胞中加入50 L裂解液, 液氮反复冻融后, 加20 L RNase(20 g/L)在4放置1min, 13000 r/min,离心30 min, 收集上清液, 样品存放-70。蛋白定量用BSA方
6、法操作, 每次上样量为300 mg。 等电聚焦电泳及银染 采用IPGphor等电聚焦系统, 把干胶条置于胶条盒中放置在IPGphor电泳仪上水化 151h, 水化完毕按500V, 1000V各1 h,000V h等电聚焦聚焦结束后, 取出胶条, 加入平衡液A振荡平衡1min, 再换平衡液B(mol/L urea, /L TrisHCl,0 g/L SDS,00 g/L甘油, 1g/L碘乙酰胺)振荡平衡1min, 取出胶条滤干。第二向SDSPAGE基本上按照Bjellguist的方法进行。采用分离胶浓度为1g/L的不连续SDSPAGE垂直平板电泳。银染按银染试剂盒操作手册操作。 图像分析 通过P
7、DQuestD分析软件系统, 分别比较4次重复结果图谱, 将HepG2和转染NOR1细胞的进行匹配分析, 获得NOR1基因转染所致的蛋白质差异表达变化, 将这些蛋白点在双向电泳凝胶图谱上标出。 蛋白质的原位酶解 蛋白质原位酶解按Fernandez5和Gharahdaghi6的方法进行。 MADLITOF肽质指纹图分析 在样品中加入10 L 1 g/L TFA水溶液, 振荡, 使样品充分溶解, 再用美国Millipore公司的10 L ZipTipTM C18器嘴脱盐。制备好的样品使用美国BRUKER公司的ProFlexTM III MADLITOF质谱仪进行分析。 2 结果 .1 阳性克隆的鉴
8、定 将挑选出来的单克隆细胞扩大培养, 抽提RNA进行RTPCR鉴定。共挑选出8个单克隆细胞, 用RTPCR鉴定, 其中有4个为阳性克隆。为了进一步确正其真实性, 对其进行Northern blot筛选分析, 结果见图1。 图1 Northern blot 筛选分析 Fig 1 Result of Northern blot analysis .2 肝癌细胞与转染NOR1的肝癌细胞的双向电泳图谱 根据杂交结果选取1号克隆为实验细胞, 抽提HepG2和稳定表达NOR1基因的HepG2阳性细胞内总蛋白, 采用双向凝胶电泳分离细胞内蛋白质, 图象扫描后用Pdquest软件分析, 可以识别700个左右的
9、蛋白质点。4次重复结果统计显示HepG2和(+)/NOR1/HepG2细胞二维图谱的蛋白质点分别为(70019)、 (70028)个, 通过IMAGEMASTER软件匹配分析后确立了10个受NOR1基因转染影响表达明显上调的差异表达蛋白质点, 通过质谱鉴定出其中6个差异点, 结果见图2。 图2 肝癌细胞与转染NOR1的肝癌细胞的双向电泳图谱 FigD of HepGand (+)/NOR1/HepGcell protEin A:D of (+)/NOR1/HepGcell protEIn; B:D of HepGcell protein. .3 质谱鉴定蛋白质 应用MALDITOFMS方法对1
10、0个差异点进行鉴定,个获得了比较可靠的结果。将获得的肽质量指纹与数据库的人类标准的肽质指纹匹配, 这些蛋白分别为: 肿瘤坏死因子受体蛋白超家族成员11, 肝磷脂结合生长因子结合蛋白; 酪氨酸蛋白磷酸化受体B(protein tyrosine phosphatase, receptor type, B); 锌指蛋白; 假设蛋白, Haptoglobin precursor等。 3 讨论 肝癌的发生发展涉及到多个基因, 这些基因在整个基因网发挥着重要的作用, 一个基因也可能通过多个基因、 多个途径来影响细胞的功能。研究表明, HepG2细胞在转染NOR1基因后, 蛋白质表达谱发生了改变, 我们鉴定
11、出6个表达明显上调的蛋白点, 其中: 包括锌指结构蛋白, 锌指结构指的是在很多蛋白中存在的一类具有指状结构的结构域, 锌指蛋白结构域能通过其保守的组氨酸、 半胱氨酸残基介导DNA, RNA及蛋白蛋白相互作用。锌指蛋白功能非常广泛, 其功能主要包括DNA识别, RNA包装转录调控, 蛋白折叠和装配、 脂质结合, 并参与生长发育过程和恶性肿瘤的形成等7,。此外, NOR1基因还可引起肿瘤坏死因子受体超家族成员蛋白的表达增加, 肿瘤坏死因子受体通过免疫调节网络在肿瘤的发生、 血管生成以及肿瘤转移中起到信号通路连接作用9, 这也可能与NOR1基因参与肿瘤坏死因子的表达调控相关, 其具体机制和作用信号通
12、路有待进一步深入研究。 【参考文献】 1 聂新民, 周 鸣, 唐 珂, 等. 一个与化学因素致鼻咽癌相关的硝基还原酶基因的克隆与鉴定J. 中国生物化学与分子生物学报,003, 19:23-428. 2 Nie XM, Zhang BC, Li GY. Cloning, Expression and Mutation analysis of NOR1, a novel human gene downregulated in HNE1 nasopharyngeal carcinoma cell lineJ. J Cancer Res Clin Oncol,003, 129:10-414.3 傅锦芳
13、, 李登清, 聂新民, 等. NOR1基因对HepG2细胞白介素8水平的影响J. 临床检验杂志,006, 14:82-284.4 傅锦芳, 李登清, 桂 嵘, 等. NOR1基因真核表达载体的构建及其对肝癌细胞生长的影响J. 中华检验医学杂志,005,8(12): 1267-1269.5 Fernandez J, Gharahdaghi F, Mische SM. Routine identification of proteins from sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis(SDSPAGE) gels or po
14、lyvinyl difluoride membranes using matrix assisted laser desorption/ionizationtime of flightmass spectrometry (MALDITOFMS)J. Electrophoresis, 1998, 19(6): 1036-1045.6 Gharahdaghi F, Weinberg CR, Meagher DA, et al. Mass spectrometric identification of proteins from silverstained polyacrylamide gel: a
15、 method for the removal of silver ions to enhance sensitivityJ. Electrophoresis, 1999,0(3):01-605.7 Ladomery M, Dellaire G. Multifunctional zinc finger proteins in development and diseaseJ. Ann Hum Genet,002,6(6):31-342.8 Laity JH, Lee BM, Wright PE. Zinc finger proteins: New insights into structural and functional diversityJ. Curr Opin Struct Biol,001, 11(1):9-46.9 郑雪平, 胡学强. GITR/GITRL系统在免疫调节中的作用J. 细胞与分子免疫学杂志,007,3:85-387. 课题份量和难易程度要恰当，博士生能在二年内作出结果，硕士生能在一年内作出结果，特别是对实验条件等要有恰当的估计。
