《浅析对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的基因多态性分型研究_1》由会员分享，可在线阅读，更多相关《浅析对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的基因多态性分型研究_1（13页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果浅析对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的基因多态性分型研究 【摘要】 目的探索一种准确、快速、可靠的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的分子生物学分型方法，了解医院内MRSA的多态性，为临床合理、有效地使用抗生素和控制耐药基因在种群间的传播提供帮助。方法用MecA基因相关高变区PCR扩增(HVR-PCR)和随机扩增多态性DNA(RAPD)两种方法，对MRSA菌株进行多态性分析。HVR-PCR检测MecA基因相关高变区正相重复序列元件(DRUs)的长度，根据DRUs数目
2、的不同对MRSA分型;RAPD根据电泳图谱中条带的数目及位置，经NTSYS统计软件进行聚类分析，得到遗传树状图，按MRSA菌株之间的相关性进行分型。结果应用HVR-PCR方法可将31株MRSA标本分为7型，分别含有7、8、9、10、11、12和16个DRUs，其中10DRUs型最多11/31(%)，16DRUs型最少1/31(%);应用RAPD分型，31株MRSA共分10型，其中以型为主10/31(%)，其他型分布比较接近。在11株HVR-PCR分型的10DRUs型中RAPD 型4株4/11(%)，RAPD 型和RAPD 型各2株2/11(%);10株RAPD 型中9DRUs型、10DRUs型
3、各4株4/10(%)。结论RAPD方法和HVR-PCR方法对MRSA的分型率都比较高，而且这两种方法都比较简单、稳定、可靠、快速，实用性强，具有广阔的应用前景。 【关键词】 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌;MecA基因;随机扩增多态性DNA;MecA基因相关高变区PCR扩增 ABSTRACT: ObjectiveTo investigate the polymorphisms of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in local hospitals in order to provide evidence for clinica
4、l doctors to use the antibiotics rationally and analyzed the polymorphisms of MRSA with themethods of PCR for mec-associated hypervariable region (HVR-PCR) and random amplifiedpolymorphic DNA (RAPD). MRSA strains typed by HVR-PCR according to the length polymorphisms which decided by the number of d
5、irect repeat unit elements (DRUs) of HVR-PCR products; Grouping of MRSA by RAPD was based on the dependability among different MRSA MRSA strains typed by HVR-PCR were divided into types which contained, 10, 11, 1and 1DRUs. MRSA strains with 10 DRUs were most predominant, present in 11/31 cases (%).
6、Among the1 MRSA strains typed by HVR-PCR, only 1 showed 1DRUs. There were 10 types classed by RAPD of all MRSA dominant type was RAPD , present in 10/31 cases (%). The others showed similar and HVR-PCR methods not also possess a good ability to obtain interpretable results, but also are simple, stab
7、le, reliable and rapid. They both have perfect practicality and prospect of extensive application. KEY WORDS: methicillin-resistant Staphylococcus aureus; mecA gene; random amplified polymorphic DNA; PCR for the mec-associated hypervariable region 葡萄球菌的分型方法很多，传统的分型方法包括血清学分型、抗生素分型等，但均无法满足精确辨别的要求。分子生物
8、学技术的出现为这一领域带来了革命。目前，分子分型方法已成为研究细菌耐药性发生及传播的重要手段，常见的有：脉冲场凝胶电泳(pulsed-fiel gel electrophoresis, PFGE)，随机扩增DNA多态性(random amplified polymorphic DNA, RAPD)，mecA基因高变区长度多态性(PCR for the mec-associated hypervariable region, HVR-PCR)，荧光扩增片段长度多态性(fluorescent amplified fragment length polymorphrism, FAFLP)等。这些方法
9、各有特点，应用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureu, MRSA)的分型在国内外均有报道，但这些方法尚未成熟，各地分型标准也不一样，且多采用单一的分型方法。RAPD 和HVR-PCR联合应用于MRSA多态性分型尚未见报道。本实验采用RAPD和HVR-PCR两种方法对MRSA菌株进行分型，了解其多态性分布状况、鉴别菌株之间的相关性，为合理、有效地使用抗生素和控制耐药基因在种群间的传播提供理论基础。 1材料与方法 材料 标本来源实验用的31株MRSA标本来源于XX年3月至XX年12月间西安交通大学医学院第一、第二附属医院的住
10、院患者。 实验仪器及试剂MicroScan auto Scan-4型全自动细菌鉴定分析;药敏试验纸片购自英国OXOID公司，Mueller-Hinton平板由本实验室自行配置;细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)、PCR试剂2Taq PCR MasterMix(含染料)、DNA Marker 均购自北京TIANGEN生物技术有限公司;溶菌酶(活力单位XXu/mg)、蛋白酶K购自Amrescos生物公司;金黄色葡萄球菌mecA基因PCR检测引物和HVR-PCR、RAPD多态性分析引物，由北京奥科生物技术有限责任公司合成。DNA扩增仪为MJ Research Inc公司的PTC-200 PCR
11、仪;稳压稳流电泳仪为美国Bio-RAD公司产品;ZF紫外分析仪购自上海小源科技有限公司。 方法 细菌鉴定用MicroScan auto Scan-4型全自动细菌鉴定分析仪鉴定MRSA，同时用PCR检测mecA基因，凡头孢西丁(FOX，30g)纸片药敏试验19mm的金黄色葡萄球菌，且mecA基因阳性者报甲氧西林耐药，即为MRSA。 引物根据GenBank中金黄色葡萄球菌MRSA基因序列选取适用引物：HVR引物序列为，P1：5-ACTATTCCCTCAGGCGTCC-3，P2：5-GGAGTTAATCTACGTCTCATC-31，RAPD引物序列为，EP007：5-AGCACGCTGTCAATCA
12、TGTA-32，KAY1：5-AGCAGCCTGC-32。 细菌DNA的提取按北京TIANGEN公司生产的细菌基因提取试剂盒(DP302)步骤，提取葡萄球菌基因组DNA。 的HVR-PCR分型取经药敏试验和基因检测为MRSA的菌株基因组DNA 1L作为扩增的模板，加入PCR反应体系：HVR P1和P2引物各1L(引物浓度10mol/L)，2PCR Master L(3mmol/L MgCl2、/L dNTP、/L Taq DNA聚合酶、20mmol/L Tris-HCl、100mmol/L KCl，含染料)，灭菌去离子水L，反应总体积为25L。PCR反应条件：94预变性5min;940s，56
13、5s，72，60s，35个循环;72延伸5min。扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染后分析结果。 的RAPD分型取经药敏试验和基因检测为MRSA的菌株基因组DNA 1L作为扩增的模板，加入PCR反应体系：RAPD引物EP001L(引物浓度10mol/L)，RAPD引物KAY1 1L(引物浓度10mol/L)，2PCR Master L(3mmol/L MgCl2、/L dNTP、/L Taq DNA聚合酶、20mmol/L Tris-HCl、100mmol/L KCl，含染料)，灭菌去离子水L，反应总体积为25L。PCR反应条件：94预变性2min;945s，345s，72，60s，35个循环
14、;72延伸5min。扩增产物经15g/L琼脂糖凝胶电泳后，在凝胶成像系统中进行成像分析。 2结果 .1MRSA的HVR-PCR分型结果应用HVR-PCR方法对31株MRSA标本进行分型，一共可以分为7型，分别含有7、8、9、10、11、12和16个DRUs。所有的MRSA都可以扩增出长度450820bp的基因片段，用HVR-PCR分型方法都可以加以区分，分型率达到了100%。DRUs的数目=(扩增的基因片段长度-171)/40，其中171是存在于扩增序列之中而没有重复的序列片段长度，40是每一个正向重复单元序列的长度。所有MRSA菌株中，10DRUs型最多(11/31，%)，其次是9DRUs型
15、(8/31，%)，11DRUs型(4/31，%)，7DRUs型(3/31，%)，12DRUs型(2/31，%)，8DRUs型(2/31，%)，最少的是16DRUs型(1/31，%)。结果见图1、表1。 .2MRSA的RAPD分型结果 .的电泳结果31株MRSA经过RAPD两条引物混合扩增分型，均可得到数量不等、位置不同的扩增条带，条带数目在16条之间，分型率达100%(图2)。图1MRSA的HVR-PCR电泳图 The electrophoresis result of HVR-PCR of MRSAM：100bp ladder DNA Marker;1、3、6、10： PCR产物长531bp，9DRUs型;2、7：PCR产物长571bp，10DRUs型;4、9：PCR产物长611bp，11DRUs型;5、8：PCR产物长651bp，12DRUs型。表1HVR-PCR的分型结果 .聚类分析结果根据RAPD电泳图谱中条带的数目及位置，经NTSYS统计软件进行聚类分析，得到遗传距离树状图。31株MRSA共分10型，其中以型为主(10/31，%)，其他型分布比较接近。根据遗传树状图分布情况可知各菌株间遗传性状，其中RAPD 型、型差异较小，均有4条带;RAPD 型、型、型遗传性状也比较接近，各有4条带，但是条带在位置上有所差别;RAPD 型、型差异
