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1、项目名称：胚胎发育的核小体重排和染色质重塑首席科学家：江赐忠 同济大学起止年限：2010年1月-2014年8月依托部门：教育部 上海市科委一、研究内容从受精卵到胚胎的发育过程是一个非常复杂的生理过程，要求基因在时空上的精确转录表达。而核小体作为染色质的最基本结构，通过屏蔽和开放DNA来调控基因的转录。前人研究已经表明在胚胎发育过程中，染色质结构发生了巨大的变化。但是，还不清楚胚胎发育、胚胎干细胞分化、以及成熟体细胞逆分化为多能干细胞（iPS细胞）的过程中核小体定位、染色质结构发生了什么样的变化？以及这些变化对胚胎发育、干细胞分化、iPS细胞多能性获得等具有怎样的决定作用？这些变化的分子机制是什
2、么？（构成核小体的）组蛋白修饰和DNA甲基化在核小体重排和染色质重塑中的作用及机制如何？以上这些都是本项目的关键科学问题。针对上述科学问题，本项目包括以下主要研究内容:1. 从胚胎发育、体细胞重编程、干细胞分化三个方向研究核小体重排和染色质重塑。具体来说:1) 在胚胎水平上, 以果蝇为模式生物, 在典型的两个发育时间点, 分别绘制果蝇胚胎高分辨率全基因组核小体图谱，再比较核小体定位和染色质结构的变化; 类似地，分析比较野生型和突变体中核小体定位和染色质结构的变化;揭示核小体定位和染色质结构变化的本质规律。以期阐明核小体定位和染色质结构在维护胚胎正常发育中的作用和分子机制。并建立一套稳定适用于多
3、物种的高分辨率全基因组核小体图谱的高效绘制方法。2) 分别绘制胚胎干细胞和iPS细胞多能性诱导后的高分辨率全基因组核小体图谱，通过比较核小体定位和染色质结构的异同, 可以揭示核小体定位和染色质重塑对这两种不同细胞维持多能性中的作用机制，这为理解干细胞分化、iPS细胞多能性获得具有重要意义。同时分析特定组蛋白修饰对核小体定位的影响，鉴定发现与体细胞重编程有关的因子，研究该因子对组蛋白特异性修饰与核小体定位的影响。2. 影响核小体重排和染色质重塑的因素很多, 其中DNA甲基化和组蛋白修饰是重要的两个。利用模式蛋白UHRF1研究DNA甲基化和组蛋白甲基化之间的互动关系, 以及二者对核小体定位和染色质
4、重塑的调控机制。再以经基因剔除处理过的小鼠胚胎干细胞为材料, 进一步研究DNA甲基化、组蛋白甲基化和核小体重排对干细胞分化的作用。3. DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑因子的作用、核小体重排和染色质重塑是个复杂的调控网络。因此，本项目还将从表观遗传组学的角度上宏观分析这一调控网络: 整合基因组学、比较基因组学和细胞信号转导通路数据，构建表观遗传组学数据中心；建立表观遗传组学分析平台；系统研究核小体重排、组蛋白修饰与转录因子之间的相互作用。另外, 本项目涉及高通量数据的处理, 我们将开发相应高通量鉴定组蛋白修饰差异和核小体定位变化的分析工具。二、预期目标总体目标：本项目以模式动物胚胎发育和细
5、胞分化过程中核小体重排和染色质重塑为基本问题，整合国内优秀团队，利用当前最先进的研究手段和技术，从分子生物学、发育学和基因组学等方向上进行研究。具体来说是，阐明果蝇胚胎发育、体细胞重编程和干细胞分化中核小体分布和染色质结构的变化规律，组蛋白修饰和染色质重塑因子对核小体重排和染色质重塑的作用机制。以期揭示核小体重排和染色质重塑在维护胚胎正常发育中的作用和分子机理，以及在体细胞重编程中的作用；同时开发高通量分析方法，建立表观遗传组学数据中心和分析平台，进一步阐明核小体重排和组蛋白修饰在基因转录调控网络中的重要作用。通过本项目的结题，将获得一批有自主知识产权的重要成果，提高国家科研实力，为解决不断上
6、升的由发育异常导致的缺陷新生儿以及预防、诊断和治疗其它与表观调控异常关联的疾病提供理论依据，并提高iPS细胞诱导效率，为加快iPS细胞在组织移植和器官移植中的临床应用打下技术基础。五年预期目标：1. 绘制果蝇胚胎发育关键时期和特定基因突变体的高分辨率全基因组核小体图谱，阐明核小体重排和染色质结构在发育过程中的变化和功能，建立一套稳定的可应用于不同物种的绘制高分辨率核小体图谱的方法。2. 绘制胚胎干细胞和iPS 细胞的高分辨率全基因组核小体图谱，分析比较二者的核小体重排和染色质重塑的异同。揭示核小体重排和染色质重塑在维持胚胎干细胞和iPS 细胞全/多能性中的作用。3. 以UHRF1为模式蛋白，研
7、究组蛋白修饰和DNA甲基化之间的互动关系，并对核小体重排的作用。利用UHRF1敲除小鼠胚胎干细胞为材料，阐明组蛋白修饰、DNA甲基化和核小体重排在胚胎干细胞分化中的作用机制。4. 开发一套高效分析鉴定核小体定位变化和组蛋白修饰差异的计算生物学方法，建立国内首个专门针对核小体定位、组蛋白修饰、顺式调控元件、及它们相互作用的表观遗传组学数据中心和分析平台。5. 预期本课题结题时，在国际一流学术刊物（IF10）上发表论文8-15篇，在有影响力的杂志（IF5）上发表论文23-38篇以上。申请专利4项以上。6. 培养博士后12-15人，博士研究生25-40人，继续培养和壮大国内核小体重排与染色质重塑在胚
8、胎发育和细胞分化中的作用这一表观遗传调控领域的专业研究队伍。三、研究方案本项目的研究设置分为四部分，力图阐明胚胎发育、干细胞分化、iPS细胞重编程过程中核小体重排和染色质重塑的机制和功能；把核小体重排和染色质重塑等表观遗传机制与发育异常相关的疾病等有机结合起来。第一、二部分分别从果蝇胚胎不同发育时期、不同突变体，及成熟体细胞向多能干细胞重编程的角度，研究组蛋白修饰、核小体定位和染色质结构的变化规律和作用机制；鉴定在成熟体细胞重编程过程中起关键作用的调控因子和信号分子，及其在核小体重排和染色质重塑中的作用机制；第三部分从关键组蛋白修饰识别蛋白出发，分析其调控组蛋白修饰、核小体定位和染色质重塑的分
9、子机制，及这些表观遗传机制在干细胞全能性维持和分化中的功能；第四部分从表观组学角度，收集和整合本项目数据与公共数据，开发集数据中心和分析平台于一体的表观组学数据综合分析系统，系统研究组蛋白修饰、核小体重排与转录因子之间的相互作用，及三者在基因转录调控网络中的协同功能。四个部分分别侧重于胚胎、细胞、基因组和高通量分析方面，进行较系统的表观遗传学研究，既突出重点，又相互促进。高分辨率全基因组核小体图谱的绘制在国际上才刚刚起步，在我国还是空白；组蛋白修饰、核小体重排和染色质重塑在iPS细胞形成中的功能和机制尚不清楚；组蛋白修饰识别蛋白UHRF2调控组蛋白修饰、核小体定位和染色质结构的分子机制还未见报
10、道。这些研究都具有很强的创新性和前沿性。本项目紧密围绕这些问题，组建国内优秀团队，以期在这些问题上获得突破。本团队成员绘制了果蝇的第一张核小体图谱，建立了稳定的iPS诱导体系，鉴定分离到UHRF2，开发了优秀的生物信息学工具，在相关领域有雄厚的基础，掌握相关的技术。因此，本团队完全能够实施本项目研究方案和取得预期目标与重大突破。下面分别详细介绍各个部分的学术思路、研究方案，以及创新性和可行性。课题一 果蝇胚胎发育过程中的核小体重排和染色质高级结构的变化果蝇从受精卵发育到成虫的过程中，DNA要进行快速的复制，基因要进行大量而精确的转录表达以供细胞分裂分化和生长发育所需。在这个生理过程中的不同阶段
11、，染色质结构相应地发生了巨大的变化。本课题以核小体为基本研究对象，探索在果蝇不同发育阶段，全基因组核小体排列分布的变化和染色质高级结构的变化，阐明它们在果蝇发育过程中影响基因转录的分子机制。具体而言，拟在果蝇发育过程中选取两个具有代表性的时间点：1）原肠形成期（Gastrulation），外胚层开始内陷形成中胚层和内胚层。2）神经分化形成期，中央神经系统（CNS）和外周神经系统（PNS）开始分化发育。收集这两个时期的果蝇胚胎，提取出单核小体。再用高通量测序技术测出核小体DNA序列，把其比对定位到果蝇基因组上。这样可以获得这些序列在每条染色体上的位置。在此基础上，利用生物信息学的方法，进一步预测
12、出核小体，并得到高分辨率全基因组核小体图谱。果蝇的基因、各种顺式调控元件、转座子等在基因组上都有很清楚的标注。通过比较研究核小体和这些元素之间的位置关系，可以得到核小体的排列分布模式。例如，核小体是富集在基因编码区还是非编码区？核小体空白区又主要分布在何处？核小体的排列分布可以揭示在果蝇发育的特定阶段，染色质开放和关闭区域的分布情况，哪些基因被激活，哪些基因处在休眠。再通过比较研究染色质开放和关闭区域的分布、激活的基因、休眠的基因在不同发育阶段的变化，可以比较清楚地阐述核小体重排和染色质结构的变化在胚胎发育中的作用机理。另外，选择果蝇 brm突变体，研究它的核小体重排和染色质重塑。brm突变导
13、致果蝇神经发育异常。（brm突变在人类则导致Williams综合症，性状包括发育迟缓， 智力发展迟缓 ，早衰，走路笨拙等。）Edward Lewis对果蝇突变体进行研究，发现果蝇不同体节有不同的发育途径，由不同基因控制，并分享了1995的诺贝尔生理学或医学奖。针对这一典型突变体，应用上述技术，分别测定 brm突变体的高分辨率全基因组核小体图谱，再和野生型的核小体图谱进行基因组学上的比较，探索二者之间的核小体重排和染色质结构变化，进一步揭示这些基因的突变如何通过影响核小体重排来调控其靶基因的转录表达，从而造成发育异常。此项研究在探索核小体重排和染色质结构变化在胚胎正常和缺陷发育中的作用机制具有重
14、大意义。总体研究方案图示如下：发育时间点2野生型果蝇胚胎果蝇 brm突变体发育时间点1野生型果蝇胚胎预测核小体构建核小体图谱比较基因组学鉴定核小体重排阐述影响胚胎发育的机理预测核小体构建核小体图谱预测核小体构建核小体图谱比较基因组学鉴定核小体重排阐述造成胚胎发育异常的机理甲醛固定裂解细胞分离染色质核酶消化得到单核小体染色质免疫沉淀收集核小体胶纯化PCR扩增测序甲醛固定裂解细胞分离染色质核酶消化得到单核小体染色质免疫沉淀收集核小体胶纯化PCR扩增测序甲醛固定裂解细胞分离染色质核酶消化得到单核小体染色质免疫沉淀收集核小体胶纯化PCR扩增测序本部分工作采用高通量测序技术研究单核小体动态分布对果蝇发育
15、过程的影响和作用机制，具有很高的创新性和可行性。在此部分研究中，我们首次在果蝇的不同发育阶段探索核小体重排和染色质高级结构对发育的影响。这是一个全新的研究思路。此外，关于果蝇高分辨率全基因组核小体图谱，目前国际上只有一篇报道，是由课题负责人于2008年发表在Nature杂志上，用的是H2A.Z核小体变体。在此基础上，本课题用野生型核小体为研究对象，因此可行性很强，在国际上也有很大的优势。这一部分课题的研究组成员，在果蝇发育、突变体培养、高通量测序技术应用和数据分析上都分别有多年的工作经验、扎实的知识与技术积累，并取得很大的学术成果，在高影响因子的杂志上发表文章。因此，本课题组的研究成员完全能够实施课题研究方案和实现预期目标。课题二体细胞重编程过程中核小体重排和染色质重塑本课题的关键科学问题包括：核移植和iPS细胞形成等体细胞重编程过程中，核小体的分布和染色质结构发生了怎样的变化？组蛋白修饰和信号转导是如何影响体细胞重编程中的核小体重排和染色质重塑的？最终组蛋白修饰、核小体重排和染色质重塑在体细胞重编程中有什么作用，作用机制是什么？针对这些问题，我们设计了如下研究方案：1 iPS细胞诱导技术的建立。在已有基础上，集中力量优化3T3细胞系iPS细胞诱导技术。2 建立和完善可诱导
