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1、从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果抗纤灵冲剂对大鼠体外肾系膜细胞增殖及分泌ECM影响的研究 【关键词】 细胞增殖 我们以前的 研究 证明，中医抗纤灵冲剂对慢性肾功能衰竭1患者及实验性慢性CRF大鼠肾脏功能和结构损害有明显的改善作用2，但作用机制尚不清楚，近年来研究表明，肾系膜细胞、细胞外基质及各种细胞因子、生长因子在肾功能进行性减退过程中起着重要作用3。本研究采用血清药 理学 方法 和MC体外培养技术，观察了抗纤灵冲剂对大鼠肾系膜细胞增殖和ECM的主要成分纤维联结蛋白、型胶原的 影响 ，并与西医
2、血管紧张素转换酶抑制剂蒙诺做对照，以期从细胞水平探讨抗纤灵冲剂防治CRF的作用机制， 发展 中医药防治CRF的 理论 认识，为进一步提高CRF的中医药诊治水平提供依据。 1 材料与方法 实验材料 抗纤灵冲剂由丹参、大黄、牛膝、桃仁、当归组成，由上海中医药大学附属曙光 医院 提供，每袋含生药9g；肾组织来源为上海必凯实验动物中心提供的SD大鼠的肾组织，体重为g，大鼠肾小球系膜细胞株由长征医院肾科提供。对照西药为血管紧张素转换酶抑制剂蒙诺，每粒10mg，由上海中美施贵宝公司提供。定量测定人血清型胶原试剂盒，由中美合资上海华泰生物工程有限公司提供。FM免疫比浊法定量试剂盒：由上海玉兰生物技术研究所提
3、供。培养条件：37、5%CO2。RPMI-1640培养基为美国GIBCO产品。胎牛血清由上海第二医科大学提供，56水浴30min灭活分装，于-20冰箱保存备用。 实验方法 动物分组 SD雄性大鼠56只，每组8只，用Platt法5/6肾切除做大鼠慢性肾衰模型，分两期完成，先背部切口切除左肾2/3，1周后切除整个右肾。假手术组仅背部切口分两次剥离左右肾包膜，保留肾上腺，根据手术后2周所测血肌酐值分组，造模组及 治疗 组大鼠经统计学处理，使分组后各组血肌酐、尿素氮值无明显差异。分为7组，假手术组；假手术加抗纤灵组；模型组；西药蒙诺对照组；抗纤灵组、丹参组、大黄组，A、C组用自来水灌胃3ml/d，B、
4、D、E、F、G组按成人常规用量的20倍给药，3ml/d灌胃，实验共进行30天，在最后一次灌胃2h后腹腔静脉无菌采血6ml，分离血清，56水浴30min灭活后分装，于-20冰箱保存备用。 体外培养的大鼠肾系膜细胞的方法 将从液氮中取出的冻存MC按细胞复苏法复苏，传代3次，按MC传代法经胰蛋白酶消化后收集于胰心管内用含20%FCS的1640培养液配成3104ml细胞悬液，接种于96孔板，每孔100l，培养箱中孵育24h后弃去培养液，换1640液继续培养24h，使大部分细胞静止于G期，弃去培养液，然后8孔1组，分别加入含AG组10%和20%血清的1640培养液，继续培养72h后，每孔加入噻唑蓝溶液1
5、0l，37继续孵育4h终止培养，弃去培养液72h后，每孔加入二甲基亚砜150l，振荡10min。于酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值。 测定大鼠肾系膜细胞分泌细胞外基质、纤联蛋白、型胶原的方法 将复苏后传代3次的MC按传代法经胰蛋白酶消化后收集于离心管内，用含20%FCS的1640培养液配成6104ml悬液转种至24孔板，每孔500l，继续培养24h，弃去上清，每孔加入含%FCS的1640培养液500l，继续培养24h，使细胞生长同步。弃去上清，含10%、20%血清的1640培养液A组各5孔，B组各7孔，C组各5孔，D、E组各10%7孔、20%8孔，每孔500l。培养72h后弃去上清，加入含%F
6、CS的培养液每孔1ml，培养24h，吸取上清，测定纤联蛋白、型胶原含量。 结果 .1 抗纤灵方对MC增殖的影响 与A组比较差异有显著性，说明肾衰血清能明显刺激系膜细胞增殖。与C组比较差异有显著性，说明抗纤灵方及其组方单味药丹参、制大黄能减轻肾衰血清对系膜细胞的刺激，明显抑制系膜细胞增殖，并呈浓度依赖性。蒙诺与抗纤灵作用相似。见表1。 表1 抗纤灵对离体大鼠系膜细胞的增殖的影响 .2 抗纤灵对大鼠肾系膜细胞分泌细胞外基质的影响 见表2。 表2 抗纤灵对大鼠肾系膜细胞分泌细胞外基质的影响 表2中数据说明肾衰大鼠血清能刺激肾系膜细胞分泌型胶原、纤联蛋白，而且与浓度呈正比。提示肾衰大鼠血清对肾系膜细胞
7、分泌型胶原的刺激作用有随浓度的增高而增高的趋势；而假手术大鼠含药血清组与假手术大鼠对照组无明显差异。10%、20%浓度能抑制肾衰大鼠血清刺激肾系膜细胞分泌型胶原、纤联蛋白，而以20%浓度的效果更为明显，说明较高浓度抗纤灵更能抑制肾衰大鼠血清刺激肾系膜细胞分泌型胶原、纤联蛋白。蒙诺作用与抗纤灵比较无明显差异。 讨论 一般认为慢性肾衰的病机是本虚标实，本虚为正虚，标实为邪实。肾病日久，气血亏虚，气机不畅，气滞血瘀，脉络阻塞，最后导致肾脏瘀血内阻，脉络阻滞而致肾病益甚。大量研究表明CRF患者或多或少见有血瘀证，因此血瘀气滞、脉络阻塞是本病的病机特点之一。临床病例亦多见不同程度的血瘀表现并伴有脾肾两虚
8、、邪浊内蕴的表现。基于此，我们研制了在扶正祛邪基础上着活血化1瘀的抗纤灵冲剂。方中丹参益气补血活血，微寒；桃仁祛瘀活血，性平；当归补血活血，性温；牛膝补肾活血，性平；制大黄，清热泄浊活血，性寒。综观全方，以活血为特征，兼以扶正泻浊，攻补兼施、温凉并用，使泻而不伤正、补而不滞邪。 现代 药理研究证实：丹参能改善组织内微循环，增强网状内皮系统的吞噬作用，促进免疫复合物在体内降解和清除，减轻免疫损伤；能抑制脂质过氧化物，减少氧自由基对细胞的损伤，能增加胶原酶的产生，增强胶原酶的活性，促进胶原降解。桃仁亦能提高肾脏血流量，改善微循环和提高组织胶原酶活性，从而促进肾内的胶原分解、代谢，减少肾内胶原的含量
9、，改善肾纤维化。大黄有缓解残余肾高代谢状态、影响氮代谢、控制细胞因子、降血脂等多种作用。 抗纤灵对体外培养肾系膜细胞的增殖的 影响 ：肾小球硬化是慢性肾衰的主要病理形态特征之一，而系膜细胞又是肾小球疾病致病因子作用的主要靶细胞之一4。正常肾小球中的系膜细胞通常处于稳定状态，无明显增殖及过度细胞外基质合成现象。当各种因素导致肾小球损害时，系膜细胞活化，通过自分泌和旁分泌方式分泌IL-1、TGF-、TNF、PDGF等细胞多肽生长因子刺激细胞增生，合成大量ECM6。并且ECM可通过ECM受体刺激细胞不断分泌细胞因子，合成ECM。可见肾小球MC增生是多种类型肾小球疾病常见而又突出的病理特征，并且是引起
10、肾小球ECM增多以及进一步导致肾小球硬化的主要原因7。因此，抑制MC增殖可以防治肾小球硬化。本实验通过肾小球系膜细胞的体外培养观察到：造模组系膜细胞增殖明显高于假手术组，说明实验性CRF大鼠血清能刺激系膜细胞增生，证明了慢性肾衰血清中有某些因子IL-1、IL-6、TGF-、TNF、PDGF等能刺激系膜细胞活化、增生以及系膜细胞增殖在肾小球损害、慢性肾衰 发展 过程中起着重要作用8。同为假手术组的对照组和抗纤灵组比较，后者系膜细胞增殖明显少于前者，说明抗纤灵在体外能抑制系膜细胞的增殖。抗纤灵组系膜细胞增殖明显少于造模对照组，说明抗纤灵在体外能抑制肾衰血清刺激系膜细胞增生。丹参组及20%制大黄组系
11、膜细胞增殖明显少于造模对照组，说明丹参及较高浓度的制大黄在体外能抑制肾衰血清刺激系膜细胞增生。可见抑制MC增生可能是抗纤灵能延缓CRF大鼠肾功能恶化的机制之一。另外从实验结果来看，含单味药丹参的肾衰大鼠血清抑制MC增殖优于含单味药制大黄的肾衰大鼠血清，这可能与丹参能改善组织内微循环、增强网状内皮系统的吞噬作用、促进免疫复合物在体内降解有关。 抗纤灵对体外培养肾系膜细胞分泌细胞外基质的影响:ECM的积聚是肾小球硬化的重要特征。体外细胞培养证实，MC激活及表型转换后，不仅产生炎症介质，而且也产生细胞外基质，既包括正常肾小球细胞外基质成分如、型胶原，LN、FN，HSPG等，也包括间质胶原即、型胶原，
12、其沉积顺序为：型胶原、LN、FN和、型胶原。生理情况下，系膜沉积的细胞外基质成分和质量均发生明显变化，不但正常细胞外基质成分明显增加，间质胶原也出现沉积，且其过度产生更是肾小球疾病后期进展性肾硬化的主要原因9。本实验通过MC的分离培养，观察到造模对照组血清能刺激MC分泌FN、型胶原，抗纤灵能抑制肾衰大鼠血清刺激MC分泌FN、型胶原，由此可见抑制MC增生及其异常分泌细胞外基质是抗纤灵能延缓CRF进展的重要机制之一。 蒙诺为血管紧张素转换酶抑制剂，通过抑制血管紧张素的作用阻断肾素血管紧张素系统，改善肾脏血流动力学。新近 研究 证实血管紧张素不仅通过血流动力学作用引起肾小球硬化，还可直接促进系膜细胞
13、增生肥大，刺激TGF-、TNF、PDGF的分泌增加，从而导致ECM合成增加。本实验发现抗纤灵冲剂与蒙诺作用相近，说明本冲剂也可能对血管紧张素的作用有所抑制，需进一步深入研究。 【 参考 文献 】 1 何立群，郑平东.抗纤灵冲剂 治疗 慢性肾衰90例临床研究. 中国 医药学报，1998，13：321-323. 何立群，郑平东，王怡.抗纤灵冲剂及拆方对肾缺血再灌注动物肾组织及血浆SOD、MDA的影响.亚洲医药，1999，10：36. 邹万忠.肾脏疾病进行损伤的病理机制.肾脏病透析肾移植杂志，1992，1：115-118. 孙喜元.肾小球损害机理研究进展.国外医学泌尿系统分册，1994，14：196
14、-199. Worf G,Ssharma K, Chen Y, et al. High glucose induced proliferation in mesangial cells is reversed by antocrine TGF-.Kidney Int，1992，42：647-656. Coritsidis G, Rifici V,Cuptas,et binding of oxidized LDL to rat glomeruli in vivo and Cultured mesagial cells in vitro. Kidney Int，1991，39:858-866. Jaffer FE, Knauss VC, Poptic E,et al. Endothel in stimulates PDGFseretion in cultured human mesangial Int，1990，38:1193-1198. 王泰华，钱家麒.系膜细胞激活与肾小球损害.国外医学泌尿系统分册，1996，16：125-127. 朱辟疆.细胞外基质与肾小球硬化.中国中西医结合肾病杂志，XX，1：123-125. 课题份量和难易程度要恰当，博士生能在二年内作出结果，硕士生能在一年内作出结果，特别是对实验条件等要有恰当的估计。
