《平面和三维培养对兔髓核细胞增殖和基质合成影响的实验研究_1》由会员分享，可在线阅读，更多相关《平面和三维培养对兔髓核细胞增殖和基质合成影响的实验研究_1（15页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果平面和三维培养对兔髓核细胞增殖和基质合成影响的实验研究 作者：朱磊，吴小涛，董寅生，王运涛，邱匀峰，张福勇，鲍军平 【摘要】 目的：探讨兔髓核细胞平面和三维培养对其增殖及基质合成的 影响 ，为椎间盘组织工程寻找一种新的种子细胞获取 方法 。方法：体外培养兔髓核细胞，分为平面培养组和PLGA支架三维培养组两组，利用倒置显微镜、扫描电镜进行髓核细胞形态学观察，MTT法测定各组髓核细胞增殖情况，HE染色、免疫组化 分析 髓核细胞型胶原的表达，阿利新兰染色法测定培养液中
2、髓核细胞合成的糖胺聚糖含量。结果：经过两周的培养，两组髓核细胞均能够增殖；与平面培养组相比，三维培养组细胞增殖率、型胶原表达量、GAG合成量均增高。结论：髓核细胞能够与PLGA支架很好地黏附并增殖；PLGA支架三维培养较平面培养能促进髓核细胞增殖，提高型胶原和GAG的合成量，可作为椎间盘组织工程种子细胞获取的一种新方法。 【关键词】 椎间盘退变； 髓核细胞； 组织工程； PLGA支架； 三维培养；兔 椎间盘退变性疾病(intervertebral disc degeneration disease，IDDD)是一类具有高发病率及高致残率的骨科疾病。临床常用的保守 治疗 和手术治疗方法不能从根本
3、上逆转椎间盘细胞的退变，远期效果不佳。椎间盘组织工程学的迅速 发展 为IDDD提供了一种新的生物学治疗方法，其目的是通过逆转椎间盘细胞水平的病理改变，进而修复和重建退变的椎间盘组织。髓核细胞的退变在椎间盘退变中起了关键性作用，因此，如何获得足量的具备正常生理功能的髓核细胞是椎间盘组织工程学要解决的核心 问题 。国外学者利用组织工程学方法，对髓核细胞的培养进行了大量的 研究 ，但利用组织工程聚乳酸(PLA)/聚羟基乙酸(PGA)复合生物材料PLGA支架三维培养髓核细胞，国内外报道尚少。本实验通过探讨兔髓核细胞平面和PLGA支架三维培养对其增殖及基质合成的影响，为椎间盘组织工程寻找一种新的种子细胞
4、获取方法。 1 材料与方法 实验动物 周龄新西兰大白兔10只，体重g，雌雄不拘。 主要仪器、材料和试剂 CO2孵箱，倒置相差显微镜，扫描电镜，PLGA 支架，胰蛋白酶、型胶原酶，D- Hank液，胎牛血清，DMEM/F12培养基、抗坏血酸、二甲亚砜(DMSO)、MTT、阿利新兰试剂、多聚赖氨酸，型胶原免疫组化一抗，多孔培养板。 实验方法 髓核细胞的分离获取和培养 取4周龄小乳兔，%戊巴比妥钠 mgkg-1肌肉注射处死，无菌条件下将胸腰段脊柱整段取出，尽量剥尽椎间盘前缘所附着的肌肉，以D- Hank液冲洗2遍，尖刀切开椎间盘纤维环，用眼科镊将胶冻状椎间盘髓核完整取出，以DMEM/F12漂洗3遍后
5、，吸取到%型胶原酶液中，3 消化1520 min，期间用吸管轻轻吹打，待组织大部分消化、培养液浑浊后用200目不锈钢网过滤，悬液1 000 rmin-1离心min，混悬计数细胞，以1105ml-1浓度接种到培养瓶中，生长培养液为DMEM/F12，置于3、饱和湿度、5%CO2孵箱中培养。每天倒置显微镜观察细胞生长情况，d换液1次。另取部分原代培养的细胞爬片行型胶原免疫组化染色鉴定。 PLGA支架材料的预处理和实验分组 先将已经制备好的PLGA支架材料用无菌手术刀片切割成周径10 mm、高mm的圆柱体，以75%酒精浸泡30 min，磷酸盐缓冲液反复冲洗后，培养箱内晾干，滴加适量多聚赖氨酸浸没支架材
6、料，静置h，吸掉多余液体，完成包被，备用。 将接近90%融合的原代髓核细胞弃去培养液，加入少量%胰蛋白酶消化细胞，倒置显微镜下观察，见细胞回缩、间隙增大时吸去消化液，加入适量含血清的培养液终止反应，用吸管轻轻吹打瓶壁细胞，使之脱落形成细胞悬液。1 000 rmin-1离心min，弃上清，培养液漂洗2次后，用生长培养液DMEM/F12混悬细胞，计数制成110ml-1细胞悬液。 将制成的髓核细胞悬液分为平面培养组和PLGA支架三维培养组两组培养。 髓核细胞的形态学观察 平面培养组：取ml 细胞悬液直接接种于6孔培养板中，共6孔，置于3、 饱和湿度、5%CO2孵箱中培养，d换液1次，每日倒置显微镜观
7、察并定期摄像。PLGA支架三维培养组：取包被后的PLGA支架8块，无菌条件下放置到两块6孔培养板中，每块支架材料内先滴加细胞悬液1 ml，培养1 h后翻转，再在另一面滴加1 ml细胞悬液，置于3、饱和湿度、5%CO2孵箱中培养，d换液1次，每日倒置显微镜观察并定期摄像。任选2块细胞支架复合物标本，在培养1周后弃掉培养液，PBS漂洗2遍后加适量预冷3%戊二醛，固定h，PBS浸洗，10 min2次，梯度酒精脱水1min2次。标本经乙腈置换、真空干燥、真空导电处理后进行扫描电镜观察摄像。 MTT法检测两组细胞增殖情况 取24孔培养板两块，一板每孔直接接种浓度为110ml-1的细胞悬液1 ml，共24
8、孔，作为平面培养组；另一板每孔放入包被后的PLGA支架1块，将浓度为110ml-1的细胞悬液1 ml接种到材料上，共24孔，作为PLGA支架三维培养组。两组均为24孔，置于3、饱和湿度、5%CO2孵箱中培养，d换液1次，培养两周，于接种后第2、5、9、14天各组分别取6个复孔，每孔加入MTT100 l，3继续孵育h，弃上清液，每孔加入DMSO 1 ml，振荡10 min后，吸取各孔液体150 l于96孔培养板，酶标仪于490 nm波长下检测各孔光密度值。 HE染色、免疫组化分析两组髓核细胞型胶原的表达 同方法，将髓核细胞分为两组接种培养：两组各6孔，置于3、饱和湿度、5%CO2孵箱中，d换液1
9、次，两组细胞各培养两周。由于前面实验已经证实原代平面培养的细胞爬片型胶原免疫组化染色呈阳性，主要着色部位是胞浆，细胞基质不表达型胶原，故将其中平面培养组髓核细胞在第10天时弃去培养液，加入少量%胰蛋白酶消化细胞，倒置显微镜下观察，见细胞回缩、间隙增大时吸去消化液，加入适量含血清的培养液终止反应，用吸管轻轻吹打瓶壁细胞，使之脱落形成细胞悬液。1 000 rmin-1离心min，弃上清，培养液漂洗2次后，用生长培养液DMEM/F12混悬细胞，制成细胞悬液，接种于PLGA支架，继续培养至第14天，以利于型胶原从胞浆分泌到细胞外基质，便于与PLGA支架三维培养组标本统一切片分析。于第14天取出两组支架
10、材料每组6块共12块，常规脱水、透明、石蜡包埋、切片、HE染色。免疫组化检测两组髓核细胞型胶原的表达，一抗为鼠抗兔抗型胶原的单克隆抗体，二抗为生物素化鼠抗鼠IgG多克隆抗体，DAB显色。免疫组化结果判断：型胶原阳性细胞间质呈棕褐色。 应用 LeicaQ50IW 计算 机图像分析系统及其软件定量评价呈阳性免疫组化染色的髓核细胞间质的灰度值，两组每块支架分别取3张切片，每张切片随机采集3个高倍视野进行测定，测得结果取平均值，作为每张切片视野内棕褐色的平均灰度值，再取每块支架的3张切片的灰度平均值，作为每块支架髓核细胞型胶原表达的间接数值。 阿利新兰染色法测定培养液中髓核细胞合成的糖胺聚糖含量 收集
11、中每次更换的培养液，-20 冰箱保存，备检。两组细胞各培养两周，将两组细胞培养时所收集的培养液和等体积的新鲜培养液分别加入倍体积的异丙醇沉淀蛋白，使用阿利新兰染色法，以6-硫酸软骨素溶液为标准品，计算所收集的两组细胞培养液中GAG含量。 统计学处理 所得数据用x-s表示，输入SPSS 统计学软件进行统计学处理，组间比较采用t 检验。 结 果 .1 髓核细胞形态学观察结果 倒置显微镜下可见原代单层培养的髓核细胞4h 后开始贴壁，细胞为多角形或梭形，呈岛状生长，胞浆内含有少量空泡，贴壁后伸出伪足。原代培养的细胞爬片行型胶原免疫组化染色呈阳性，主要着色部位是胞浆，细胞基质和细胞核不着色。原代髓核细胞
12、大约1d左右达到90融合。传至第1代后分为平面和PLGA支架三维培养，平面培养的髓核细胞保持原代多角形或梭形的细胞形态，PLGA支架三维培养组倒置显微镜下显示髓核细胞转为圆形或类圆形，4h后开始黏附在支架边缘，随着时间的推移，细胞和支架表面结合更加紧密，由原位向周围增殖、爬行，并逐渐向支架网孔中长入，细胞间接触增多，支架孔隙结构存在，支架暴露面逐渐减小。培养1周后进行扫描电镜观察，可见PLGA支架呈网状结构，在支架的网状孔眼中可见圆形或类圆形髓核细胞黏附，呈单个或者多个细胞簇样生长。 .2 MTT法检测两组细胞增殖结果 如表1所示，各组OD值随培养时间的延长而增大，间接反映了各组细胞数随时间的
13、增加而增加。培养各时段，除分组培养后的第2天差异无统计学意义外，PLGA支架三维培养组在第5、9、14天均高于平面培养组，差异有非常显著的统计学意义。表1 两组髓核细胞增殖结果比较 PLGA支架三维培养组 ） ） ） 1）与平面培养组比较，P .3 HE染色、免疫组化 分析 两组细胞型胶原表达结果 两组细胞支架复合物切片HE染色，可见两组髓核细胞呈圆形或类圆形，细胞基质均有大量胶原组织，但PLGA支架三维培养组细胞基质胶原组织较平面培养组细胞基质胶原组织要致密很多，着色更加明显。免疫组化显示两组细胞基质型胶原均呈棕褐色的阳性反应，胞浆几乎不着色。经图像分析软件测得每张切片视野内棕黄色的平均灰度
14、值，再取每块支架的3张切片的灰度平均值，作为每块支架髓核细胞型胶原表达的间接数值，结果，PLGA支架三维培养组型胶原表达高于平面培养组，统计学差异非常显著。见表2。表2 两组髓核细胞型胶原合成定量分析和培养液中GAG含量 .4 阿利新兰染色法测定培养液中髓核细胞合成的GAG含量结果 见表2。PLGA支架三维培养组培养液中髓核细胞合成的GAG含量明显高于平面培养组。 讨 论 以椎间盘突出症为主要代表的一系列IDDD临床上常用的 治疗 方法 是保守治疗和手术治疗。前者常出现复发；而手术治疗为有创治疗，会破坏脊柱的稳定性和完整性，伴有许多并发症。理想的治疗方法是针对退变的原因，通过人工干预，早期阻止
15、或逆转椎间盘细胞水平的退变，恢复其生物学功能，即椎间盘退变的生物学治疗。近几年来，椎间盘组织工程学成为骨科生物学 研究 的新领域，为IDDD的生物学治疗提供了新的思路，其 目前 的研究主要集中于种子细胞的选择、接种培养种子细胞的生物载体支架材料以及相关生长因子三方面。 种子细胞的选择是椎间盘组织工程的核心所在，由于髓核细胞的退变在椎间盘退变中起了关键性作用，因此选择髓核细胞作为种子细胞着手研究是比较适宜的。如何获得足量的具备正常生理功能的髓核细胞，国外学者就这一 问题 进行了大量的研究1-，获得了良好的结果，结论提示了髓核细胞体外平面培养增殖缓慢，三维培养可以促进其增殖和细胞外基质分泌，其形态学亦发生变化。 对椎间盘组织工程种子细胞支架材料的选择也是国内外学者研究的热点。理想的支架材料应该为种子细胞提供良好的生长和代谢微环境，利于细胞黏附生长、营养成分渗入、进行气体交换和排除代谢产物，并使细胞按预制形态的三维支架生长5。这就要求支架材料在具有三维立
