《对小鼠黑色素移植瘤血管生成拟态中作用的研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《对小鼠黑色素移植瘤血管生成拟态中作用的研究（25页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果对小鼠黑色素移植瘤血管生成拟态中作用的研究 作者：张凡 孙保存 常永霞 赵秀兰 【摘要】 目的：利用小鼠移植瘤模型动态观察CD31、MMP2、MMP9、CathepsinD在恶性黑色素移植瘤血管生成拟态形成中的作用。 方法 ：采用B16黑色素瘤细胞株制作小鼠恶性黑色素移植瘤动物模型，成瘤后根据随机数字表每天随机抽取一只小鼠处死，共12d，获得肿瘤样本114例；HE染色、CD31、CathepsinD、MMP2、MMP9、HMB45免疫组织化学染色和PAS染色；分
2、别计数血管生成拟态周围及远离血管生成拟态区域肿瘤细胞中阳性细胞百分率；内皮依赖性血管周围及远离内皮依赖性血管区域肿瘤细胞中阳性百分率；连续计数10个高倍视野并取其均值。结果：在恶性黑色素移植瘤形成的第18天，肿瘤组织内存在血管生成拟态；第912天移植瘤中的血管生成拟态被内皮依赖性血管替代；血管生成拟态周围肿瘤细胞中CD31、MMP2阳性细胞百分率高于远离血管生成拟态区域的阳性细胞百分率;内皮依赖性血管周围肿瘤细胞CD31阳性细胞百分率与远离内皮依赖性血管区域的阳性细胞百分率之间存在明显差别；血管生成拟态周围肿瘤细胞MMP9阳性细胞百分率高于内皮依赖性血管周围的阳性细胞百分率；血管生成拟态密度与
3、血管生成拟态周围肿瘤细胞CD31、CathepsinD、MMP2阳性细胞百分率之间存在相关，与肿瘤细胞中MMP9阳性细胞百分率之间不存在相关；内皮依赖性血管密度只与内皮依赖性血管周围肿瘤细胞中CD31阳性百分率之间存在相关，与CathepsinD、MMP9、MMP2之间不存在相关。结论：恶性黑色素瘤移植瘤中血管生成拟态与内皮依赖性血管共存，且与内皮依赖性血管之间存在一定的时空变化 规律 。CD31、CathepsinD、MMP2、MMP9、HMB45等参与了黑色素瘤血管生成拟态的形成，其中CD31、MMP2作用尤其重要。 【关键词】 血管生成拟态;肿瘤血管生成;细胞粘附分子;恶性黑色素瘤;基质
4、金属蛋白酶 【ABSTRACT】 Objective: To study the effectiveness of CD31、MMP2、MMP9、CathepsinD on Vasculogenic mimicry in the melanoma transplant : The mouse melanoma transplant tumor model of mouse was made with B1melanoma cell suspending liquid. When tumor appears, we choose one mouse each day randomly accor
5、ding to random number chart and kill get tumor specimens of 11cases totally; which normally will have HE stain CD31、CathepsinD、MMP2、MMP9、HMB4immunohistochemistry stain and PAS stain. Then respectively count the percentage of positive cells in tumor around the Vasculogenic mimicry and the percentage
6、of positive cells in tumor which is far away from the Vascuolgenic mimicry;count the percentage of positive cells in tumor around the endothelialdepended vessel and that of positive cells in tumor which is far away from the endothelialdepended cell. Results: The Vasculogenic mimicry and endotheliald
7、epended vessel coexist in the tumor tissue at the early phase of melanoma (d1d8);From day to day 12,this structure is replaced by the endothelialdepended vessel. The number of CD31、MMPpositive cell around vasculogenic mimicry is more than that of the tumor which is far away vasculogenic mimicry. The
8、 ratio of CD31 positive cell around endothelialdepended vessel has significant difference with that of tumor far away from it. The number of MMPpositive cell around vasculogenic mimicry is more than that of tumor around endothelialdepended are correlation between vasculogenic mimicry density and the
9、 number of CD31、MMPpositive cells around vasculogenic mimicry,while the density of endothelial vessel has correlation with the number of CD31 positive cell around endothelialdepended vessel. But the density of endothelialdepended vessel have no correlation with the number of MMP2、 MMP9、CathepsinD po
10、sitive cell around endothelial : The vasculogenic mimicry is one sort of special bloodproviding pattern. The CD31、Cathepsin D、MMP2、MMPall take part in the development of vasculogenic mimicry and CD31、MMPplay key role in this process. 【KEY WORDS】 Vasculogenic mimicry;Angiogenesis;Cell adhesion molecu
11、le;Malignant molenoma;Matrix metalloprotEinase 血管生成拟态是1999年美国lowas大学的Maniotis和Folberg等根据他们对眼葡萄膜恶性黑色素瘤微循环的 研究 结果，发现的一种与传统的肿瘤血管生成途径完全不同的、不依赖内皮细胞的全新的肿瘤细胞的血液供应方式16。恶性黑色素瘤细胞通过自身变形和与细胞外基质相互作用，模拟血管壁结构形成可输送血液的管道，从而重塑肿瘤的微循环，并且与宿主血管相连通，使肿瘤获得血液供应，命名为血管生成拟态。这种特殊的肿瘤血供模式与内皮依赖性血管的生成在很多方面存在不同。研究证实具有血管生成拟态的肿瘤恶性度高，生长
12、迅速，易发生血道转移。 本研究在以前实验的基础上首次提出了血管生成拟态的时空变化概念：即血管生成拟态是肿瘤血液供应的一种暂时性替代模式，在肿瘤发生 发展 的一定时期内存在，在肿瘤的不同区域存在不同的变化趋势。本研究的前期实验通过小鼠的恶性黑色素移植瘤模型，初步验证了我们提出的假说。本实验利用免疫组织化学方法对血管生成拟态的形成机制以及与内皮依赖性血管之间的联系做进一步的探讨，深入揭示两者之间的变化规律。 1 材料和方法 实验动物：C57小鼠购自北京军事医学 科学 院动物室，68周龄，共20只，雌雄各半，体重2530g，编号后洁净实验室饲养，饮用水和饲料由天津医科大学实验动物中心提供。 实验方法
13、：先将黑色素瘤细胞株B16复苏，1640细胞培养基上培养6d，使细胞排满瓶底，%胰酶消化成单细胞悬液，调整细胞密度达到1107/ml。75%酒精消毒小鼠鼠蹊部，每只小鼠鼠蹊部皮下注射细胞悬液。10d后接种部位开始出现皮下肿块。根据随机数字表每天抽取一只小鼠处死，共持续12d。解剖并仔细检查动物全身，共获得肿瘤样本114例。全部标本均经10%福尔马林固定，然后常规石蜡包埋。 染色方法 试剂：一抗CD31、HMB45为鼠抗小鼠单克隆抗体，即用型，6ml包装，SNATA CRUZ生产，进口分装；CathepsinD、MMP2、MMP9兔抗多克隆抗体，浓缩型，包装，购自武汉博士德试剂公司；二抗、三抗为
14、SP复合物和山羊抗兔PV6001，购自北京中山试剂公司。PAS液为天津肿瘤 医院 病理室自行配制。 主要免疫组化步骤：二甲苯脱蜡、梯度酒精至水，3%双氧水灭活内源性过氧化酶，PBS缓冲液振洗，抗原微波热修复，正常山羊血清封闭、一抗冰箱过夜，二抗、三抗各1hDAB显色1015min，复染核脱水透明，中性树胶封片。 CD31、PAS双重染色：先挑选2例正常胃粘膜样本进行对照染色，分泌粘液处均染成樱桃红色，证实PAS试剂质量可靠。先按照SP法进行CD31免疫组织化学染色，DAB显色后显微镜下观察，待血管内皮细胞着棕黄色后水冲数分钟终止显色，然后用%高碘酸溶液还原切片10min，时间切不可过长以避免出
15、现假阳性结果。水流冲洗数分钟后置于schiff液中，避光1015min，自来水冲洗，显微镜下观察出现樱桃红色，苏木素浅染细胞核，盐酸酒精分化，氨水返蓝后，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。 计算 机图象处理 使用空军总医院医学工程研究所的BIN DAF IMG图象采集处理系统计算每张切片中坏死面积。 计数方法 区域划分：中央区与外周区的划分：避开肿瘤坏死,将每张切片中肿瘤组织镜下视野均匀分成三等份，即内1/3、中1/3、外1/3三个区域，内1/3区域即为中央区，外1/3即为外周区。血管生成拟态周围与远离血管生成拟态、内皮依赖性血管周围与远离内皮依赖性血管的划分：以血管生成拟态、内皮依赖性血管为中心的高倍视野定义为血管生成拟态、内皮依赖性血管周围；距离上述视野一个高倍视野的肿瘤细胞即为远离血管生成拟态和内皮依赖性血管。血管生成拟态判断标准：无内皮细胞衬复的PAS阳性管道、衬复PAS阳性物质的肿瘤细胞围成不规则管腔，且管腔内存在红细胞，周围没有出血坏死和炎症细胞浸润。 计数方法：低倍镜下找到血管生成拟态和内皮依赖性血管存在的典型区域，换成高倍镜，连续计数10个高倍视野内的血管生成拟态、内皮依赖性血管，取其均值即为血管生成拟态密度、内皮依赖性血管密度。同时计数血管生成拟态周围、内皮依赖性血管周围、远离血管生成拟态、远离内皮依赖性血管的肿瘤细胞中各种指标阳
