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1、从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果大鼠原位肝移植模型的手术操作技巧探讨 【摘要】 目的 建立一个稳定的大鼠原位肝移植模型，探讨其手术技巧。 方法 在Kamada“二袖套法”的基础上进行改良。供体改经腹主动脉进行肝脏冷灌注；肝上下腔静脉用连续缝合法吻合，门静脉和肝下下腔静脉用袖套法吻合，胆总管采用单管内支架胆管端端吻合法。结果 共施行大鼠原位肝移植140例，无肝期平均11 min，手术成功率为97%，大鼠1周存活率为95%。结论 改良的两袖套法具有操作简便、无肝期短、手术成功率高、大鼠术后存活时间
2、长的优点，是大鼠原位肝移植的理想术式。娴熟细致的外科操作、受体无肝期的长短是决定动物存活的关键。 【关键词】 肝移植 大鼠 动物模型 Techniques of orthotopic liver transplantation in rats YU Rusheng， WANG Yong， QIAN Haixin. Department of General Surgery, the First Affiliated Hospital of Suzhou University， the Key Lab of Clinical Immunology of Jiangsu Province, Suz
3、hou15006 Abstract Objective To establish a reliable rat model of orthotopic liver transplantation and discuss its operating techniques. Methods The model was established with modified double-cuff method. The liver of donor was perfused through the abdominal aorta with cold fluid. The anastomosis of
4、the suprahepatic vena cave (SVC) was sutured end-to-end with-0 nylon line， and the continuity of infrahepatic vena cave (IVC) and portal vEin (PV) were connected by means of cuff techniques respectively. The bile duct anastomosis was linked by internal stent. Results One hundred and forty cases of r
5、at orthotopic liver transplantations were performed. The mean time of anhepatic phase was 11 minutes. Thehours and 1 week survival rates were7% and5%， respectively. Conclusion Our modified double-cuff method has the character of limited anhepatic phase, long survival rates and is convenient and easy
6、 to repeat. It is an ideal model. Skilled surgical techniques and shortening the anhepatic phase of recipient are the keys to animal survival. Key words liver transplantation； rats； animal model 大鼠原位肝移植是多步骤，较为复杂的手术， Kamada等1创建的双袖套法是进行大鼠原位肝移植的经典方法，许多学者在此基础上又进行了各种改进，优劣不一。我们在参照Kamada法及各家经验2-3的基础上, 进一步简
7、化了手术步骤, 改进了肝上下腔静脉的缝合，缩短了无肝期的时间，降低了操作难度，成功地建立了大鼠原位肝脏移植模型，报告如下。 1 材料和方法 材料 健康雄性SD大鼠共280只，质量220250 g，受体质量略大于供体。受体手术前禁食1h，自由饮水。肝下下腔静脉、门静脉袖套管由聚乙烯导管制成，门静脉袖套内径为，长约mm，肝下下腔静脉袖套内径为，长约mm，胆总管插管采用小儿硬膜外导管内径为，长约mm。显微手术器械1套，双极电凝器1台，两人裸眼操作，清洁手术。 12 方法 121 供体手术 供体采用氯胺酮腹腔注射麻醉，100 mg/kg。取上腹部肋缘下切口，进腹后，将肠管推向左下腹，温盐水纱布裹覆，暴
8、露肝下下腔静脉和肝门部。游离肝下下腔静脉直至右肾静脉开口水平，分别电凝切断腰静脉、右肾上腺静脉；暴露胆总管，在肝管汇合部远端处剪开胆总管前壁。向近端插入自制胆总管插管，4-0丝线结扎固定。于插管处远端剪断胆总管。游离门静脉, 电凝切断幽门静脉，游离出部分腹主动脉，用小儿细静脉留置针穿刺腹主动脉，1号丝线固定，同时剪开膈肌,血管钳阻断胸主动脉。4乳酸钠林格氏液(含肝素/ml)灌注肝脏，压力为60 cm水柱，流速约ml/min；经胸腔剪开肝上下腔静脉，平右肾静脉开口远端剪断肝下下腔静脉，使灌注液顺利流出，分离切断肝周韧带，切断肝上下腔静脉周围膈肌，均匀灌注肝脏至淡土黄色，剪断门静脉，取出供肝，置入
9、04灌注保存液中。 122 修肝 剥离门静脉壁上的脂肪组织，用微血管镊穿过自制袖套管管腔，夹住门静脉端后外翻于套管壁，6-0丝线在袖套管烙痕内结扎。同法处理肝下下腔静脉，修剪肝上下腔静脉：紧贴膈肌环下缘修剪，去除膈肌和膈肌环，尽可能长地保留肝上下腔静脉前、后壁。在肝上下腔静脉孔的两角用6-0的带针线各缝一针支持线。 123 受体手术 采用氯胺酮腹腔注射麻醉，70 mg/kg，持续面罩吸氧。取上腹部肋缘下切口，进腹后，电凝并切断剑突以增加暴露，如供体暴露肝下下腔静脉和肝门部，在右肾静脉上缘平面游离肝下下腔静脉，电凝切断腰静脉、右肾上腺静脉。自肝下下腔静脉开始，顺时针方向游离肝周韧带，电凝左膈静脉
10、；充分游离肝上下腔静脉。游离胆总管，在分叉处切断，将远端胆总管翻向下方，Prolene-0线结扎并切断肝固有动脉。在脾静脉水平上方游离门静脉，使整个肝脏仅留下腔静脉、门静脉与体相连。微血管夹阻肝下下腔静脉及门静脉，无肝期计时。在门静脉分叉处穿刺，缓慢注入40贺斯液ml左右，用小satinsky钳阻断肝上下腔静脉，近肝切断肝上下腔静脉、门静脉和肝下下腔静脉，移除肝脏。将供肝从4的冰浴中取出，原位放入肝脏腔隙内，将供肝右侧6-0血管缝线与受者肝上下腔静脉右侧角缝合打结，供肝左侧6-0血管缝线与受者肝上下腔静脉左侧角缝合打结，然后自左向右连续缝合下腔静脉后壁，锁边后再作腔静脉前壁连续缝合至左侧角。生
11、理盐水冲洗血管腔排出气泡，与线尾打结，完成肝上下腔静脉缝合。微血管夹夹闭供肝肝下下腔静脉，将阻断受者门静脉的微血管夹下移，排出门静脉内少量血液及血块，肝素生理盐水冲洗后，迅速插入供者门静脉袖套管，在袖套管烙痕内用3-0丝线结扎。移去门静脉微血管夹及肝上下腔静脉satinsky钳，供肝恢复血流，结束无肝期。大量预热40生理盐水冲洗腹腔复温。同法套扎肝下下腔静脉。将胆总管支架管插入受者胆总管管腔内，3-0丝线结扎，大网膜覆盖供肝胆总管，固定。丝线单层连续关腹。 124 术后处理 手术结束后，将大鼠放置于电热毯上并加用烤灯复温20 min，持续吸氧。完全清醒后单笼饲养，自由进糖盐水，术后第1天自由进
12、食。 结果 我们完成了140 例大鼠原位肝移植手术。早期练习阶段的40例不纳入统计。供体手术时间2530 min，供肝冷灌注4min。受体门静脉驱血约，肝上下腔静脉吻合5min，平均为min，门静脉和肝下下腔静脉套管约需要及 min，无肝期为(112)min，平均为11 min，受体手术时间4050 min。大鼠术后2h 内死亡视作手术死亡，共计3例。其中肝上下腔静脉吻合口出血1 例，门静脉袖套脱落出血1 例，受体肝上下腔静脉回流不畅1例，手术成功率达97。术后第4天、第6天不明原因死亡各1例。其余均存活1周以上。 讨论 1 麻醉选择及程度掌控 氯胺酮具有对呼吸、循环抑制较轻，对氧和二氧化碳分
13、压 影响 较小及肝毒性较小等优点，符合肝脏移植的麻醉要求，且一次性给药，操作方便。但是氯胺酮麻醉的个体差异甚大，麻醉过深可导致呼吸抑制，甚至呼吸、心跳骤停，发生时大鼠常表现为呼吸浅慢、叹气样呼吸、口唇及四肢发绀。尤其是对受体大鼠，麻醉过深严重影响术后生存率。预防麻醉意外的最好 方法 是：严格掌握麻醉剂的用量，初次给予适量的麻醉剂，麻醉变浅时再追加剂量。对受体，麻醉深度以切皮及分离肝动脉时，大鼠轻微躁动为好。 2 袖套管及胆管插管的准备 为确保袖套管环扎稳定，可以在一端导管壁用烧灼后的刀片制作烙痕，以利于结扎，防止袖套滑脱。注意不要烫穿，以免使内壁不光整及套接后漏血。胆道插管的导管可用小儿硬膜外
14、导管拉长制备，两端剪成斜面，以利插入。但不宜过长以免引起胆汁淤积于管壁,造成胆道梗阻(一般不宜超过mm)。 3 供体肝下下腔静脉的切断水平 我们是在平右肾静脉上缘处切断肝下下腔静脉，故省去了右肾动、静脉的断扎，节约了手术时间。这样所获的肝下下腔静脉虽然较短，但也足够套管所需。 4 经腹主动脉灌注供肝 灌注的效果直接影响到手术结果，灌洗必须缓慢而均匀，压力过大会引起肝窦内皮细胞水肿，造成再灌注障碍。缓慢、均匀地灌注是获取色泽均匀、质地柔软供肝的重要保障。我们采用的是经腹主动脉的持续灌注，部分灌注液经肝动脉入肝，部分通过腹腔脏器回流后经门静脉入肝，收到肝动脉及门静脉双重灌注的效果。此法不会发生灌注
15、压力过高，避免了对肝脏微血管的损伤。持续灌注直至门静脉离断，保证了肝脏在切取过程中始终保持一个低温环境，减轻了肝脏热缺血损伤。灌洗液量以肝脏完全淡土黄色为准。 5 供肝的游离 供肝翻动可能导致枯否氏细胞激活，增加供肝对保存再灌注损伤的敏感性，影响供肝质量。灌注前，除游离肝下下腔静脉稍许翻动尾状叶外，不翻动供肝，尤其注意避免肝叶扭转导致灌注不均。待供肝冷灌注约min后开始游离切断肝周韧带。游离肝脏时采取顺时针方向游离，这可减少反复翻动肝脏。肝动脉、左膈下静脉、肝食管血管支均不需处理。门静脉游离至脾静脉开口水平并在其分叉处切断，尽可能将血管剥离清楚，少带脂肪组织。 6 修肝 所获的供肝立即放入冰浴水中，清除门静脉、肝下下腔静脉开口附近的结缔组织，以利于翻套。翻套成功后，结扎线要打在烙痕中，才不易滑脱。静脉浸于水中，其开口多半会 自然 显露，故不要将其提出水面，在牵拉的状况下寻找开口，那样容易撕破血管壁。另外，静脉断端要剪平齐，否则牵拉时容易撕破。 7 受体肝游离、切除 受体术前即可在腰下垫一小棉垫以增加暴露，无肝期结束后移除。腹腔暴露时，不可将肠管提出腹腔外，以免增加体液丢失及体温散失。肝上下腔静脉游离一定要彻底，尽可能地使血管裸露化，否则，在过多残留韧带的牵拉下，切断血管后断端回缩，
