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1、为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划革兰氏痰涂片的镜下怎样描述报告革兰氏染色法的原理及其练习摘要：革兰氏染色反应是细菌重要的鉴别特征，所以学习微生物学，进行革兰氏染色实验是很重要的。为保证染色结果的正确性，采用规范的的染色操作方法是十分必要。本实验主要对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌进行革兰氏染色，观察它们的染色特征，辨别是革兰氏阴性还是阳性，从而掌握其染色方法。染色方法与过程很清晰，但实验结果中金黄色葡萄球菌(Rosenbach）多组呈现假阴性。本实验的主要目的是熟悉并掌握革兰氏染色方法及原理，但要想做出很好的染
2、色得多加练习。本实验还可以锻炼显微镜操作技术和无菌操作技术。关键词：革兰氏染色大肠杆菌()金黄色葡萄球菌(S.aureusRosenbach)枯草杆菌()引言革兰氏染色是微生物学中最重要的鉴别染色方法，它可以直接将细菌分为革兰氏阴性和革兰氏阳性。革兰氏染色法可将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性两种类型，这是由这两种细菌细胞壁结构组成与结构的差异所决定的。经过一定的染色过程后，革兰氏阳性的细菌会因为细胞壁肽聚糖的含量高，脂质含量低而保持第一次染色的蓝紫色。革兰氏阴性细菌细胞壁的脂质含量高，乙醇处理时脂质溶解，蓝色被洗脱，复染后变为红色。革兰氏染色原理很简单，染色时需注意要注意使用处在活跃生长期的细
3、菌，涂片不宜过厚，严格控制脱色时间。大肠杆菌()是革兰氏阴性细菌，金黄色葡萄球菌(S.aureusRosenbach)与枯草杆菌()都是革兰氏阳性细菌，染色后在显微镜下容易区别。同时它们的形态各异，可以根据具体颜色和形态差异来判断染色是否成功。本实验还涉及到高倍油镜的使用。使用油镜与用一般的镜头不同，具体使用在实验方法中描述。材料菌种大肠杆菌16小时牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物，金黄色葡萄球菌16小时牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物，枯草杆菌16小时牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物。溶液与试剂无菌生理盐水，草酸铵结晶紫染液，卢戈氏碘液，95%乙醇，番红复染夜，香柏油，二甲苯仪器酒精灯，载玻片，显微镜，双层瓶
4、，接种环，滴管等方法制片：取活跃生长期菌种按常规方法涂片、干燥和固定。染色初染：滴加草酸结晶紫染液覆盖涂菌部位，染色2min，水洗至流出水无色。媒染：用卢戈氏染液冲去残留水迹，再用碘液覆盖1min，倾去碘液，水洗至流出水无色。脱色：将玻片上的水用吸水纸吸取，用滴管流加95%乙醇脱色，稍后立即洗去乙醇。复染：将玻片上的水用吸水纸吸去，用番红复染液染色2min，水洗，吸去残水烤干。镜检分别用香柏油覆盖涂菌部位，先用低倍镜找到菌，换用色情况。观察结束后，用二甲苯擦洗镜头。的物镜观察染2实验结果与分析结果分析大肠杆菌竟革兰氏染色后呈现红色，3个图片上都是红色，因此大肠杆菌应该是革兰氏阴性细菌，与事实相
5、符，染色成功。金黄色葡萄球菌比较难染色，从结果中可以分析，前两个涂片的菌种可能培养的时间太长了。因为老龄的革兰氏阳性细菌会被染成红色而造成假阴性，老龄的G+细菌细胞壁老化，不能在乙醇处理的时候使肽聚糖网孔收缩而使碘-结晶紫复合物滞留在细胞壁，从而在复染时被染红。枯草杆菌染色结果很好，蓝紫色很明显，染色成功。小结1、获得本实验成功的关键：固定时烘烤要适度，太轻会在冲洗时冲走细菌，过度会破坏细菌形态；脱色的时间要严格控制，脱色不够造成假阳性，脱色过度会出现假阴性；选用新培养的菌种，涂片时不能太厚。这些问题在实验过程中几乎都有出现，尤其是对于初学者，特别需要注意。2、革兰氏染色可以迅速将细菌分为阴性
6、和阳性，是很重要的染色方法，也是相当复杂的染色方法。通过练习革兰氏染色，既掌握了一般的染色方法，又为以后技术要求更高的染色，观察，鉴别奠定了基础。革兰氏染色镜检的操作规程1.目的：鉴定G阳性菌.G阴性菌。指导临床用药。2.原理：革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家所创立的，此方法可将所有的细菌分G+和G-两大类，G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄，交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖
7、层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染性的颜色。3.实验器材：载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜。4.试剂：试剂R1结晶紫110mlR2碳酸钠110mlR3碱性碘液110mlR4丙酮酒精120mlR5碱性复红110ml5.标本采集与处理：阴道,子宫等分泌物应由医生采集,收集于无菌试管内送检。载玻片的预处理:载玻片用前以乙醇擦拭脱脂，经干燥、清洁、无油污、无划痕的新载玻片制备涂片。在玻片背面一端的1/3处注明编号。涂片：用棉签可直接在玻片上均匀涂抹.菌液涂片时,用接种环沾取菌液,点在玻片上.51,在盐水中涂布。6.染色方法:将标本均匀涂布于玻片上,自然干燥,火焰固定。冷却后加R1、R2
8、各两滴初染30秒后水洗。用R3媒染30秒.水洗后用R4脱色至无兰色脱落为止(约有5-10秒),水洗。用R5复染5秒,水洗,待干,镜检。7.镜检:取已干燥的涂片,用低倍镜览片,再用高倍,最后用油镜观察,并在已干燥的涂片滴1-2滴香柏油,仔细观察.判断菌体的革兰氏染色反应性,呈紫色为G+菌,呈红色为G-.8.报告方式:检出革兰氏阳性球菌,革兰氏阳性球菌.检出革兰氏阴性球菌，革兰氏阴性球菌。9.实验完后的处理:显微镜头的处理:用擦镜纸将油镜头的油擦去,再用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2-3次,最后用干净的擦镜纸将镜头擦2-3次.注意向一个方向擦拭.废弃标本和污物的处理:染色玻片放入5%84消毒液中浸泡
9、30-60分钟,消毒液要每天更换.废弃标本及污物应弃于有盖的污物桶内,由专人收并送焚烧炉内彻底焚化.10.注意事项:涂片应均匀,厚薄适度,自然干燥后再加热固定.脱色要至无兰色脱落为止.52种染液质量,以免发生误差.11.临床意义.鉴别细菌选择药物12.参考文献:全国临床检验操作规程(中华人民共和国卫生部医政司)53革兰氏染色法革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师、细菌学家ChristainGram创立。细菌先经碱性染料结晶染色，而经碘液媒染后，用酒精脱色，在一定条件下有的细菌此色不被脱去，有的可被脱去，因此可把细菌分为两大类，前者叫做革兰氏阳性菌，后者为革兰氏阴
10、性菌。为观察方便，脱色后再用一种红色染料如碱性蕃红、稀释复红等进行复染。阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色。有芽胞的杆菌和绝大多数的球菌，以及所有的放线菌和真菌都呈革兰氏正反应；弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽胞杆菌都呈现负反应。革兰氏阳性菌对青霉素敏感，革兰氏阴性菌对链霉素敏感。可根据革兰氏染色法鉴别不同菌种并对症下药。革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在化学组成和生理性质上有很多差别，染色反应不一样。现在一般认为革兰氏阳性菌体内含有特殊的核蛋白质镁盐与多糖的复合物，它与碘和结晶紫的复合物结合很牢，不易脱色，阴性菌复合物结合程度底，吸附染料差，易脱色，这是染色反应的主要依据。另外，阳性菌菌体等电点较
11、阴性菌为低，在相同PH条件下进行染色，阳性菌吸附碱性染料很多，因此不易脱去，阴性菌则相反。所以染色时的条件要严格控制。例如，在强碱的条件下进行染色，两类菌吸附碱性染料都多，都可呈正反应；PH很低时，则可都呈负反应。此外，两类菌的细胞壁等对结晶紫碘复合物的通透性也不一致，阳性菌透性小，故不易被脱色，阴性菌透性大，易脱色。所以脱色时间，脱色方法也应严格控制。G菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈紫色。G菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，沙
12、黄复染后呈红色。革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：）涂片固定。在无菌操作条件下，用接种环挑取少量细菌于干净的载玻片上涂布均匀，固定。）草酸铵结晶紫染1分钟。）自来水冲洗，去掉浮色。)用碘-碘化钾溶液媒染1分钟，倾去多余溶液。）用中性脱色剂如乙醇或丙酮酸脱色30秒，革兰氏阳性菌不被褪色而呈紫色，革兰氏阴性菌被褪色而呈无色。）用蕃红染液复染30秒，革兰氏阳性菌仍呈紫色，革兰氏阴性菌则呈现红色。革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌即被区别开。实验四革兰氏染色法一、目的要求了解革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的方法。二、基本原理革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。
13、它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G表示；染色反应呈红色的称为革兰氏阴性细菌，用G表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙
14、醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液的颜色，因此呈现红色。+-革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料初染液；媒染剂；脱色剂和复染液。碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95的酒精。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+
15、和G-两大类群，常用的复染液是番红。三、器材大肠杆菌，枯草芽孢杆菌；革兰氏染色液，载玻片，显微镜等。四、操作步骤1涂片将培养1416小时的枯草芽孢杆菌和培养24小时的大肠杆菌分别作涂片，干燥、固定。固定时通过火焰12次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。2染色初染加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。脱色将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约2030秒钟，立即用水冲净酒精。复染用番红液染12分钟，水洗。镜检干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片，作革兰氏染色对比。革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；
