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1、为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划酶活力测定实验报告蛋白酶的发酵及酶活力测定实验报告学院：生物科学与工程学院专业：生物技术班级：1班姓名：学号：摘要：蛋白酶是一类重要的工业用酶，广泛应用于食品、医药、洗涤剂、皮革、酿酒等行业。当前，食品工业用酶主要来自微生物，尤其是蛋白酶的应用最为广泛。作为一种生物催化剂,它具有催化反应速度快,无工业污染,催化反应条件适应性宽等的性质和优点。由于从(来自:写论文网:酶活力测定实验报告)植物和动物中生产蛋白酶具有的局限性,为了满足当今世界市场的需要,人们越来越多地把目光投到微生物蛋白酶
2、上。微生物由于具有生长速度快、所需生长空间小、广泛的生化多样性及其遗传可操作性等特点,因而备受人们青睐。本文主要进行了菌种的生长曲线的绘制与菌种最佳发酵产酶时间等方面的研究。2关键字：蛋白酶生长曲线酶活力第一章前言研究的目的与意义蛋白酶是工业酶中用得最多的一种酶，是催化蛋白质肽键水解的一类酶,它作用于蛋白质,将其分解为蛋白胨、多肽及游离氨基酸1，约占酶总量的60%，其中碱性蛋白酶就占25%。有调查显示，酶制剂市场量最大的是洗涤剂用酶，第二位是淀粉加工用酶，以后依次为乳制品加工业、制酒工业、纺织工业和饮料加工业等用酶。与动、植物来源的蛋白酶相比，利用微生物产的蛋白酶有易于培养、生长快、产量高、易
3、于提取，适于大规模工业化生产，培养基的成本相对较低等优点，使微生物成为生产蛋白酶的重要来源和首选材料。2国内外研究概况微生物蛋白酶的分类由于从植物和动物中生产蛋白酶具有的局限性,为了满足当今世界市场的需要,人们越来越多地把目光投到微生物蛋白酶上。当前工业用酶主要来源于微生物，微生物来源的蛋白酶按其作用的pH值的不同可分为三类，即碱性蛋白酶、中性蛋白酶及酸性蛋白酶，它们作用的最适pH值分别为碱性、中性及酸性。在食品工业中的应用蛋白酶在食品工业上的应用主要是用在制干酪，蛋白质水解调味液，烤焙食品，肉类嫩化，功能性低聚肽和阿斯巴甜的合成等。食品加工使用的蛋白酶通常来自于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、米
4、曲霉和黑曲霉等。随着社会发展和生活水平不断提高，人们对肉类的需求量日益增长的同时，对肉的品质也提出了更高要求。微生物蛋白酶肉类嫩化剂是一种专门用于嫩化肉类的生物制剂，在适当温度下，可以断裂蛋白质中的某些肽键，提高肉的嫩度，使肉变得多汁、柔软、易于咀嚼，提高了肉的成品率、保质期和经济效益，因此十分经济且便于生产，并能取得显著效果。面包制作过程中，面粉中含有的不溶解性谷蛋白可以通过碱性蛋白酶限制性降解来修饰。用米曲霉蛋白酶和肽酶对面筋蛋白作有限的水解，可改善面团操作性能和机械性能，以适应不同制品的需要。酶处理后的面团其韧性和机械强度都有所增加。过量使用蛋白酶能减少面团的混合时间和增加面包产量。使用
5、细菌蛋白酶可以增加面团的延展性。43本实验的研究内容通过研究产蛋白酶菌来了解蛋白酶产生菌的生长情况，学会绘制其生长曲线，了解蛋白酶的性质及蛋白酶的测定原理，掌握蛋白酶的发酵及酶活力测定方法和掌握一定的知识与技能。第二章材料与设备菌种产蛋白酶芽孢杆菌培养基牛肉膏蛋白胨培养基酪素培养基主要试剂材料福林试剂、/L的碳酸钠溶液、/L的三氯乙酸、/LNaOH溶液、1mol/L和/L盐酸溶液、硼酸缓冲液(pH=)、10g酪素溶液、100ug/mLL-酪氨酸标准溶液主要仪器设备UV1000分光光度计、恒温水浴锅、量筒、容量瓶、漏斗、试剂瓶、移液枪、吸管、离心管、枪头、摇床、培养基第三章分析测定方法福林-酚试
6、剂法福林-酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色(钼蓝和钨蓝混合物)，由于蛋白质分子中有含酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等)，可使蛋白质及其水解产物呈上述反应。因此可利用此原理测定蛋白酶活力。通常以酪蛋白为底物，在一定pH值和温度条件下，同酶液反应，经一段时间后终止酶促反应，经离心或过滤除去酪蛋白筹沉淀物后取上清液，用Na2CO3碱化，再加入福林-酚试剂显色，蓝色的深浅与滤液中生成产物酪氨酸量成正比;酪氨酸含量用分光光度计在680nm波长处测定，从而计算出蛋白酶的活力。蛋白酶活力测定方法按中华人民共和国专业标准SB/T10317-1999：蛋白酶活力测定法测定。5标准曲线的制作加完之后，置
7、于40+水浴中显色20min，取出，用分光度计于波长680nm，10mm比色皿，以不含酪氨酸的对照管为空白，分别测定其吸光度值。以吸光度值A为纵坐标，酪氨酸的浓度C为横坐标，绘制标准曲线，计算出OD680=1时的浓度，即为吸光常数K值。计算出OD680=1时的浓度，即为吸光常数K值，K=。酶活力数值计算：X=A3K34/103n班级：植物092姓名：徐炜佳学号：淀粉酶活性的测定一、研究背景及目的酶是高效催化有机体新陈代谢各步反应的活性蛋白，几乎所有的生化反应都离不开酶的催化，所以酶在生物体内扮演着极其重要的角色，因此对酶的研究有着非常重要的意义。酶的活力是酶的重要参数，反映的是酶的催化能力，因
8、此测定酶活力是研究酶的基础。酶活力由酶活力单位表征，通过计算适宜条件下一定时间内一定量的酶催化生成产物的量得到淀粉酶是水解淀粉的糖苷键的一类酶的总称，按照其水解淀粉的作用方式，可分为-淀粉酶和-淀粉酶等。-淀粉酶和-淀粉酶是其中最主要的两种，存在于禾谷类的种子中。-淀粉酶存在于休眠的种子中，而-淀粉酶是在种子萌发过程中形成的。-淀粉酶活性是衡量小麦穗发芽的一个生理指标,-淀粉酶活性低的品种抗穗发芽,反之则易穗发芽。目前,关于-淀粉酶活性的测定方法很多种,活力单位的定义也各不相同,国内外测定-淀粉酶活性的方法常用的有凝胶扩散法、3,5-二硝基水杨酸比色法和降落值法。这3种方法所用的材料分别是新鲜
9、种子、萌动种子和面粉,获得的-淀粉酶活性应该分别是延二、实验原理萌发的种子中存在两种淀粉酶，分别是-淀粉酶和-淀粉酶，-淀粉酶不耐热，在高温下易钝化，而-淀粉酶不耐酸，在下则发生钝化。本实验的设计利用-淀粉酶不耐热的特性，在高温下下处理使得-淀粉酶钝化而测定-淀粉酶的酶活性。酶活性的测定是通过测定一定量的酶在一定时间内催化得到的麦芽糖的量来实现的，淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖，可用3,5-二硝基水杨酸试剂测定，由于麦芽糖能将后者还原生成硝基氨基水杨酸的显色基团，将其颜色的深浅与糖的含量成正比，故可求出麦芽糖的含量。常用单位时间内生成麦芽糖的毫克数表示淀粉酶活性的大小。然后利用同样的原理测得两种淀
10、粉酶的总活性。实验中为了消除非酶促反应引起的麦芽糖的生成带来的误差，每组实验都做了相应的对照实验，在最终计算酶的活性时以测量组的值减去对照组的值加以校正。在实验中要严格控制温度及时间，以减小误差。并且在酶的作用过程中，四支测定管及空白管不要混淆。三、材料、试剂与仪器实验材料：萌发的小麦种子仪器：722光栅分光光度计(编号)DK-S24型电热恒温水浴锅(编号L-)离心机(TDL-40B)容量瓶：50ml1，100ml1小台秤研钵具塞刻度试管：15ml6试管：8支移液器烧杯试剂：1%淀粉溶液；的柠檬缓冲液：A液B液取A液、B液混匀即为柠檬酸缓冲液；3，5-二硝基水杨酸溶液；麦芽糖标准液；NaOH四
11、、实验步骤1.酶液的制备称取2克萌发的小麦种子与研钵中，加少量石英砂，研磨至匀浆，转移到50ml容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，混匀后在室温下放置，每隔数分钟振荡一次，提取15-20分钟，于3500转/分离心20分钟，取上清液备用。2.-淀粉酶活性的测定取4支管，注明2支为对照管，另2支为测定管于每管中各加酶提取液液1ml，在70恒温水浴中准确加热15min，在此期间-淀粉酶钝化，取出后迅速在冰浴中彻底冷却。在试管中各加入1ml柠檬酸缓冲液向两支对照管中各加入4mlNaOH，以钝化酶的活性将测定管和对照管置于40恒温水浴中准确保温15min再向各管分别加入40下预热的淀粉溶液2ml，摇匀，立即放入
12、40水浴中准确保温5min后取出，向两支测定管分别迅速加入4mlNaOH,以终止酶的活性，然后准备下步糖的测定。3.两种淀粉酶总活性的测定取上述酶液5ml于100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。混合均匀后，取4支管，注明2支为对照管，另2支为测定管，各管加入1ml稀释后的酶液及柠檬酸缓冲液1ml，以下步骤重复-淀粉酶测定的第及第的操作。4.麦芽糖的测定标准曲线的制作取15ml具塞试管7支，编号，分别加入麦芽糖标准液，计算上表中第4行数据均值，填入上第5行中，根据标准曲线的方程，计算第5行OD值所对应的麦芽糖浓度，填入最后一行，如上表。根据以上的数据整理的结果，结合以下公式计算两种淀粉酶的活性
13、：?淀粉酶活性?样品稀释总体积样品重?5?样品稀释总体积(?)淀粉酶活性?样品重?5A-淀粉酶测定管中的麦芽糖浓度A-淀粉酶对照管中的淀粉酶的浓度B(-+-)淀粉酶总活性测定管中的麦芽糖浓度B(-+-)淀粉酶总活性对照管中的麦芽糖浓度计算结果如下：-淀粉酶活性(-+-)淀粉酶活性-淀粉酶活性-1鲜重?分钟-1）六、结果分析七、思考题1、酶活力测定实验的总体设计思路是什么？实验设计的关键你认为是什么？为什么？答：利用酶的专一性或酶活力的影响因素抑制除待测酶以外的其它酶活性，通过测酶促反应的产率推算酶活力大小。关键在于抑制其它酶的活力而不影响测定酶，这样可以减小或避免其它酶产物给测定结果带来的误差
14、。2、本实验最易产生对结果有较大误差影响的操作是哪些步骤？为什么？怎样的操作策略可以尽量减少误差？答：浸提步骤。70温度或15min时间控制不严格不准确则可能导致淀粉酶未完全钝化使测得活性偏大。应严格控制温度和时间。70水浴后需要立即冰浴，否则淀粉酶复性使测得淀粉酶活性结果偏大。向测定管中加入NaOH时应迅速，否则酶与底物继续反应使结果偏大。3、?-淀粉酶活性测定时70水浴为何要严格保温15分钟？保温后为何要立即于冰浴中骤冷？答：由于?-淀粉酶不耐热，在70下处理一定时间可以钝化，严格保温15分钟可以达到理想的钝化效果，时间过长，?-淀粉酶活性也会受到影响；时间不足，?-淀粉酶钝化不完全。保温
15、后立即骤冷是为了通过剧烈的温变改变?-淀粉酶的结构以防止在随后的反应中复性，这样就保证了在随后的40温浴的酶促反应中?-淀粉酶不会再参与催化反应。此外我认为冰浴使酶迅速降温，便于严格控制高温处理时间的长短。4、柠檬酸缓冲液的作用？各管于40水浴准确保温15分钟的作用？答：酶实验体系的pH值变化或变化过大，会使酶活性下降甚至完全失活。加入的缓冲液调至酶促反应的最适pH，同时稳定溶液的pH不至于在反应过程中大幅波动。40水浴准确保温15分钟为调整酶促反应的最适温度5、众多测定淀粉酶活力的实验设计中一般均采取钝化?-淀粉酶的活力而测?-淀粉酶和测总酶活力的策略，为何不采取钝化?-淀粉酶活力去测?-淀粉酶活力呢？这种设计思路说明什
