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1、为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划酵母双杂交,报告基因实验材料菌株酵母菌株AH109，带有四个报告基因，ADE2，HIS3，MELI和lacZ，在三个不同的GAL4上游激活序列和TATAbox的控制下ADE2和HIS3提供了营养选择标记，可以减少假阳性克隆的机率：MELI编码-半乳糖苷酶，当底物X-Gal存在时，阳性克隆就会变成蓝色；lacZ编码-半乳糖苷酶，当底物为X-Gal存在时，阳性克隆就会变成蓝色。该菌株具体特点见图3-1，3-2。图3-1酵母菌株AH109的报告基因图3-2酵母菌株表现型质粒载体阳性对照质粒
2、pGBKT7-53；阴性对照质粒pGBKT7-Lam；对照的AD质粒载体pGADT7-RecT均为clontech公司提供。HerringtestescarrierDNA购自invitrogen公司。载体信息见表3-1。表3-1本实验所用酵母双杂交载体信息培养基YPDA培养基Tryptone20g/LYeastextract10g1LAdeninehemisulfute30mg/LAgar20g/L定容至950ml，PH=116高压灭菌15min，冷却至55时加入50m1过滤灭菌的40%的葡萄糖。营养缺陷培养基YNB/LAgar20g/L根据不同的营养选择性培养基加入如下的dropoutSol
3、ution粉剂：SD/-Leu-Trp：在不含任何氨基酸的SD培养基中加入二缺粉剂/L。SD/-His-Leu-Trp(三缺)：在不含任何氨基酸的SD培养基中加入三缺粉剂/L。SD/-His-Leu-Trp-Ade：在不含任何氨基酸的SD培养基中加入四缺粉剂/L定容到950ml，高压灭菌后加入灭菌的40%葡萄糖50ml，倒平板，于4保存。主要试剂1TE/LiAc10TE1ml10LiAc1mlddH208ml合计10ml1PEG/LiAc50%PEG4000(polyethyleneglycol)8ml10TE1ml10LiAc1ml合计10mlZbuffer:Na2HPO47H2O/LNaH
4、2PO4/LKCl/LMgSO47H2O/LX-galstocksolution：X-gal溶于DMF中，终浓度20mg/ml。Zbuffer/X-galsolution：Zbuffer100mlMEX-galstocksolution实验原理实验原理见。实验方法酵母菌株AH109感受态细胞的制备从-70冰箱是取出冻存的酵母菌株AH109，在YPDA培养基平板上划线，放入30的培养箱中倒置培养直至菌落直径长至2-3mm。用接种环取新鲜的AH109单菌落1个，放入装有1ml液体YPDA培养基离心管中，涡旋打散菌落。将打散的菌液全部转入含50mIYPDA液体培养基的250m1的三角瓶中，30230
5、rpm条件下摇大约18小时.检测OD600大于。取浓度符合要求菌液大约25m1加入含300m1YPDA液体培养基的1000ml的三角瓶中，30230rpm继续摇大约3小时，使OD600在左右。将摇好的菌液加入50ml灭菌离心管，在室温下，3000rpm离心10min。弃上清，用10m1的无菌水重悬细胞沉淀。室温下，3000rpm离心10min。弃上清，用1m1的1TE/LiAc重悬细胞，备用。酵母双杂交载体的共转化pGBKT7-53和pGADT7-T共转化入AH109作为阳性对照。pGBKT7-lam和pGADT7-T共转化入AH109作为阴性对照。AH109划线二缺平板作为空载体对照。预先取
6、出鲑鱼精DNA于98变性10min，迅速置于冰上。各取2ul质粒DNA和10ul鲑鱼精DNA，加入100ul酵母感受态细胞并混合均匀。加入600ul1PEG/LiAC，高速振荡均匀后30200rpm振摇30min。加入70ulDMSO，轻轻混匀，置于42热激15min。迅速置于冰上冰浴12min，3000rpm离心10min收集菌体。悬浮菌体于300ul1TE中，全部涂于二缺平板上。待菌液充分吸收后，30倒置培养35天。共转化阳性克隆的进一步验证pGBKT7-53和pGADT7-T共转化入AH109作为阳性对照。pGBKT7-lam和pGADT7-T共转化入AH109作为阴性对照。AH109划
7、线三缺、四缺平板作为空载体对照。待二缺平板上生长出直径2-3mm的阳性菌落后，挑取阳性克隆于三缺平板上划线，并倒置于30培养35天，观察酵母菌生长情况。待三缺平板上生长出阳性克隆后，同挑取三缺平板上阳性克隆于四缺平板上划线，并倒置于30培养35天，观察酵母菌生长情况。-半乳糖苷酶显色反应检测lacZ报告基因pGBKT7-53和pGADT7-T共转化入AH109作为阳性对照。pGBKT7-lam和pGADT7-T共转化入AH109作为阴性对照。自四缺平板上用无菌牙签挑取阳性克隆于新鲜四缺平板上活化培养34天。准备浸泡于新鲜配置的Zbuffer/X-gal溶液的无菌滤纸及干燥的无菌滤纸。将活化的阳
8、性克隆用接种环取少量沾在干燥滤纸的相应位置，并做好标记。将带有酵母菌的无菌滤纸放入液氮中冷冻10s，置于室温裂解15min。重复三次。再将该滤纸置于被显色液浸湿的另一滤纸上，是菌落面朝上，室温孵育48小时，观察颜色变化，直至出现明显颜色为止。蓝色菌落即为lacZ+阳性克隆。介绍试剂盒物品清单额外附加物品列表酵母菌株酵母载体方法简述：单杂交文库的构建和筛选方法简述：双杂交文库的构建和筛选构建用于酵母单杂交的报告质粒载体构建用于酵母双杂交的DNA-BD融合载体构建生成cDNA文库构建和筛选酵母单杂交和双杂交文库酵母单杂交文库的构建和筛选酵母双杂交文库的构建和筛选方法A:通过酵母配对来筛选目的蛋白方
9、法B:通过共转化的方法筛选目的蛋白分析阳性相互作用结果问题解决指南参考文献相关产品附录A:双链cDNA合成的典型结果附录B:酵母感受态的制备LiAc法附录C：单杂交对照载体信息附录D：双杂对照载体信息目录表格列表TableIBDMatchmaker酵母菌株的基因型TableIIBDMatchmaker酵母菌株的表型TableIII单杂交系统的载体TableIV双杂交系统的载体TableV各BD-MatchmakerDNA-BD载体的比较TableVIRNA起始浓度和PCR扩增循环数之间的关系TableVII单杂交共转化的对照实验的设置TableVIII单杂共转化对照实验：期望的结果TableI
10、X双杂交转化的对照实验的设置TableX双杂交配对筛选的对照实验的设置TableXI双杂交共转化的对照实验的设置TableXII双杂交共转化的对照实验：期望的结果TableXIII用于PCR筛选菌落的AssemblingMasterMixs图片列表Figure1使用BDMatchmaker单杂交系统筛选蛋白-DNA相互作用4Figure2使用BDMatchmaker单杂交系统筛选蛋白-蛋白相互作用4Figure3酵母单杂交和双杂交筛选的大致步骤Figure4构建和筛选BDMatchmaker酵母单杂交和双杂交文库Figure5酵母菌株AH109和Y187中的报告基因Figure6BDMatch
11、maker酵母单杂交文库的构建和筛选Figure7BDMatchmaker酵母双杂交文库的构建和筛选Figure8用BDSMART技术合成高质量的dscDNAFigure9BDCHROMASPIN纯化柱和收集管Figure10通过酵母重整合作用来构建AD融合文库Figure11为双杂交筛选AD融合文库Figure12分析和证明可能的单杂交和双杂交相互作用阳性结果的策略Figure13通过酵母配对来验证蛋白-蛋白相互作用Figure14用对照用人胎盘PolyA+RNA合成双链cDNAFigure15p53HIS对照载体的图谱Figure16pGAD-Rec2-53AD对照载体的图谱Figure1
12、7pGADT7-RecTAD对照载体的图谱Figure18pGBKT7-53DNA-BD对照载体图谱Figure19pGBKT7-LamDNA-BD对照载体图谱介绍BDMatchmakerTMLibraryConstruction&Screening试剂盒提供一种简便的方法构建cDNA文库用来进行酵母双杂交和单杂交的筛选，这些试剂盒结合了BDMatchmakerTMSystems和BDSMARTTMcDNASynthesis的技术，只需要用任何组织的1gpolyA+RNA或totalRNA就能构建cDNA文库。通过一般细胞内克隆步骤，你能利用BDMatchmakerSystems所提供的灵敏的
13、转录方法所构建的文库来进行单杂交或双杂交实验。单杂交实验的原理蛋白-DNA相互作用实验单杂交实验使你能够确定和描述蛋白与目的顺式DNA激活序列的绑定，该序列可能是处于最小限度的启动子上游的用于增强转录的元件。这个实验也可以用于预测或新蛋白的DNA绑定结构域的确定。通过BDMatchmakerOne-HybridSystem你可以很容易的获得这些基因表达的蛋白在BDMatchmakerOne-Hybrid实验中，潜在的DNA绑定蛋白基因是与克隆在pGADT7-Rec2上GAL4激活结构域序列一起融合表达的。一个或多个目的DNA序列的串联拷贝被构建在pHIS2。DNA绑定蛋白和目标序列的相互作用会
14、激活HIS3的转录，该过程要在宿主菌株Y187中进行并在缺少组氨酸的培养基生长双杂交实验的原理蛋白-蛋白相互作用的原理双杂实验分析能用于鉴定新的蛋白与蛋白相互作用、确定疑似作用、明确结构域。在一个BDMatchmaker双杂交实验分析中，诱饵基因是与GAL4DNA绑定结构域序列融合表达的，同时其他的基因或其cDNA与GAL4激活域序列融合表达。当诱饵与文库融合蛋白在AH109这样的报告菌株中相互作用，DNA-BD和AD相接近结合，并激活报告基因转录双杂和单杂文库的建立和筛选双杂和单杂文库的建立和筛选由四个主要步骤组成，。如果想去筛选双杂交相互作用，第一步是建立一种DNA-BD融合载体。第二步是使用试剂盒所提供BDSMART试剂从你所抽提polyA和totalRNA建立cDNA文库。就酵母双杂筛选而言，如果你打算我们从预制的BDMatchmakercDNA文库选取来替代自己准备文库，可以跳过RNA分离、cDNA合成、AD融合文库构建。这些包含非常广泛组织的文库被有效的保存在甘油中或预转化到Y187酵母菌株。我们也提供一种BDMatchmaker文库服务，基于这个服务，提供给我们你想筛选的组织与细胞，我们为你制作AD融合文库。请注意，我们尽管在高拷贝酵母表达载体中建立了很多的预制和预转化的BDMatchmakerc
