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1、项目名称：基因组稳定性和细胞周期调控相关蛋白质群的功能及作用机制研究首席科学家：尹玉新 北京大学起止年限：2010年1月-2014年8月依托部门：教育部一、研究内容（一）拟解决的关键科学问题面对我国生命和健康科学的重大需求和癌症等重大疾病研究的挑战，结合我们前期的研究基础，本项目将围绕遗传物质稳定性这一中心课题，选择细胞周期调节的各个环节，从蛋白质群入手解决如下关键科学问题：1. 蛋白质群在细胞生长分裂过程中细胞周期各个阶段的调控机制和相互作用。相关的信号传导通路在细胞增殖过程中如何维持遗传物质的稳定性。细胞异常增殖过程中相关蛋白质群的变化规律及其对细胞周期和基因组稳定性的影响。2. PTEN
2、在有丝分裂过程中调节蛋白质群的机制。抑癌基因PTEN与p53通路之间的蛋白质网络群的联系。细胞增殖和凋亡的分子调控机制，Hippo信号通路及微管结合蛋白在其中发挥的作用。（二）主要研究内容1. 研究真核细胞DNA复制及检验点维持遗传物质稳定性的机理，确定DNA复制起始蛋白Sap1的相互作用蛋白及阐明它们的生化功能；大规模确定新的DNA复制蛋白；阐明Dna2维持DNA复制叉稳定的机理以及Cds1-Dna2的检验点通路，揭示检验点在维持遗传物质稳定性中的作用；从G1、S期细胞中鉴定新的受GSK-3调控的基因或蛋白质群，并挑选适当的功能基因或蛋白，在细胞水平和整体水平（动物模型）分析、验证，且探讨其
3、机制及意义。 2. 检测有丝分裂期间PTEN及其调控的蛋白质群的作用机制，鉴定更多PTEN调节的与有丝分裂相关的蛋白质群；检测PTEN与这些蛋白质群的物理性相互作用；通过基因敲除小鼠模型和转基因小鼠模型评价有丝分裂破坏与肿瘤发生的关系；深入探讨PTEN与p53调节的蛋白质群之间的分子网络。3. 以癌症和衰老模型为主要研究对象，对前期已鉴定出的，与癌症发生或转移及衰老密切相关蛋白进行生物学功能及蛋白质糖基化修饰研究，探究其相互作用和信号转导途径，从蛋白质水平上揭示肿瘤或衰老细胞增殖异常的分子机制。研究调控细胞周期G1和M期的新蛋白Mig-2，通过对其所调节蛋白质群的相互作用研究，揭示其调控细胞周
4、期和肿瘤侵袭性生长的分子机制。4. 筛选Hippo通路上游调节蛋白及下游靶基因，探索该通路已知蛋白之间的动态互作及通路激活机制，检测Hippo通路核心蛋白调控细胞增殖与凋亡，进而影响基因组稳定性的分子机制；探索Hippo信号通路与PTEN以及Rassf、EB1和CYLD等微管结合蛋白之间的关系，解析上述各蛋白协同或独立调控细胞增殖与凋亡、影响基因组稳定性的分子机理。二、预期目标（一）总体目标瞄准国家战略需求和国际肿瘤相关科学研究前沿，从与遗传物质稳定性相关蛋白质群这一关键科学问题出发，在细胞周期的各个环节探讨相关蛋白质群的分子调控机制以及相互作用网络。在此基础上，鉴定一批新的与细胞正常、异常增
5、殖调控相关的蛋白质群，建立全细胞水平的细胞周期相关蛋白质数据库；确定一些与维持遗传物质稳定性相关的关键蛋白质群的结构、功能、相互作用和一些重要靶蛋白的动态调控机制，并研究它们的信号调控网络。此外，还将探索一些与细胞周期失调后决定细胞命运的信号通路调控细胞增殖和凋亡的分子机制。通过本课题的实施将使我国在细胞周期调控相关蛋白研究的相关领域达到或领先国际水平。同时，以本项目的实施为契机, 促进蛋白质组学、生物学、医学、生物信息学等多学科研究的衔接和集成，培养一批交叉学科新型研究队伍。（二）五年目标1. 确定DNA复制起始蛋白Sap1的相互作用蛋白及阐明它们的生化功能；大规模确定新的DNA复制蛋白；阐
6、明Dna2维持DNA复制叉稳定的机理以及Cds1-Dna2的检验点通路，揭示检验点在维持遗传物质稳定性中的作用。鉴定G1、S期细胞中新的受GSK-3调控的基因或蛋白质群及其机制和意义。2. 评价PTEN及其调控的蛋白质群在控制有丝分裂中的作用并且探讨PTEN对这些蛋白质群的表达调控和物理相互作用，鉴定更多与有丝分裂调控相关的蛋白质群。揭示抑癌基因PTEN与p53之间的分子网络，为临床诊断和化疗提供理论基础。3. 揭示蛋白质群在肿瘤发生和转移及衰老中的生物学功能，着重研究调控细胞周期的新蛋白Mig-2的信号传导通路，通过对其所调节的蛋白质群的研究，揭示其调控细胞周期的分子机制。通过稳定同位素标记
7、建立细胞核蛋白质动态表达分析鉴定的实验方法，并由此获得新的标志蛋白；针对所发现的新的相互作用蛋白，验证其与靶蛋白的相互关系并确定其生物功能并鉴定出关键核蛋白质修饰类型与可用于新药开发的重要靶标，并探讨其在肿瘤治疗、延缓衰老和保护细胞方面应用的可能性。4. 阐明Hippo通路各组成分子间相互作用机制，鉴定新的靶蛋白及其在Hippo通路中的作用；鉴定Hippo通路上游分子和分析通路激活机制；揭示Hippo信号通路核心分子对基因组稳定性的调控机制；分析CYLD和EB1等微管结合蛋白调节细胞增殖与凋亡的分子机制；探讨Hippo信号通路与微管结合蛋白质群的关系及其在调控细胞分裂和诱发凋亡中的作用。5.
8、取得具有国际影响的原创性成果，在国际重要学术刊物上发表高水平论文50篇以上。其中，在影响因子大于10的刊物发表15-20篇，培养一批从事肿瘤基础研究和转化医学的交叉学科人才。三、研究方案（一）总体研究思路、技术路线及可行性分析1. 总体研究思路在细胞增殖过程中遗传物质的稳定性有赖于细胞周期的系统调节，DNA的精确复制和DNA损伤的修复。蛋白质群在此过程中的相互作用使细胞周期的精密调控成为可能。机体通过细胞周期调控维持基因组稳定性，这一过程是经由细胞周期的各个环节实现的。细胞周期分为G1、S、G2和M期，研究细胞周期的调控应该分解到细胞周期自然过程的各个环节中。细胞周期调控的正常进行以及遗传物质
9、的稳定性与肿瘤的发生以及衰老等生命重大事件密切相关。因此，鉴定参与调控细胞周期各个环节的蛋白质群并且评价这些蛋白质群在调控细胞周期的各个阶段、维持基因组稳定性中所发挥的作用机制以及蛋白质群之间的相互作用对于癌症等重大疾病研究至关重要。对我们认识与了解这些疾病发生的机理，有效防治这些疾病具有重大意义。基于以上思路，本课题重点围绕细胞周期的各个环节相关蛋白质群开展研究，阐明这些蛋白质群在细胞周期各个时期：DNA复制、合成、有丝分裂期的调控机制。评价蛋白质群对于细胞周期调控正常进行，维持遗传物质稳定性中的作用。在此基础上，我们将利用一个大型高通量蛋白质分析平台，大规模鉴定和分析与细胞周期调控和维持基
10、因组稳定性相关的蛋白质群，探究其相互作用蛋白和信号转导途径。此外，我们还将研究多细胞生物如何处理细胞周期失调而发生遗传物质不稳定的情况下而对细胞命运进行调节，探讨细胞生存、死亡与遗传物质稳定性的综合关系，即在细胞周期失调、基因组不稳定的情况下通过何种机制调控细胞命运，对细胞生存和死亡进行决断。这将不仅阐释机体清除癌细胞的机制，还将为癌症治疗提供更多的靶向药物选择。附图：主要技术途径流程图2. 技术路线根据我们的学术思路，本项目的总体研究技术途径如附图所示。研究细胞周期的各个时期相关蛋白质群的结构、功能、调控机制和相互作用，并且阐述细胞正常增殖过程中遗传物质稳定性的维持。还将研究细胞异常增殖中蛋
11、白质群的变化和细胞凋亡的程序控制。主要途径为：【课题一】用遗传的方法筛选Sap1温度敏感株的抑制蛋白；直接从细胞内分离Sap1的蛋白复合体；用蛋白亲和层析的方法分离Sap1的相互作用蛋白。并用生化，遗传及荧光单分子技术阐明一些已知及一些新确定的DNA复制蛋白的生化作用机理；阐明Dna2维持DNA复制叉稳定的机理以及Cds1-Dna2的检验点通路，用基因干扰技术（RNAi）揭示该通路相关的检验点在维持遗传物质稳定性中的作用。采用基因表达谱芯片或蛋白组学的方法，与课题二和课题三合作，筛选受GSK-3调控的基因或蛋白质群，鉴定G1、S期细胞中新的受GSK-3调控的基因或蛋白质群并且探讨其机制和意义。
12、【课题二】确定PTEN在维持有丝分裂检验点中的重要地位，利用基因芯片技术鉴定出新的PTEN调节基因群并且深入了解其调控机理。采用染色质-免疫共沉淀（Chromatin-Immunoprecipitation, ChIP）方法确定PTEN与染色质之间的相互作用从而探讨PTEN调控其靶基因表达的机理。利用蛋白质Pull-down分析系统大规模鉴定与PTEN相互作用的有丝分裂相关的蛋白质群。通过传统的蛋白质-蛋白质相互作用实验（IP-western）、定向诱变、荧光素酶分析等方法检测PTEN与这些新鉴定出的有丝分裂相关蛋白质群的物理性相互作用，利用课题组三的蛋白质分析平台鉴定PTEN与这些蛋白质群物
13、理性相互作用的结构域及蛋白质修饰位点。通过建立小鼠动物模型从活体角度综合评价PTEN通路以及相关蛋白质群在调节有丝分裂进程、维持遗传物质稳定性的重要性。最后利用这一动物模型揭示抑癌基因p53与PTEN的分子网络关系及其在抗癌过程中的作用。【课题三】以癌症和衰老模型为主要研究对象，探讨在细胞异常增殖过程中相关蛋白质群，如Mig-2信号通路的变化规律。通过对目的基因进行表达干预（过表达或沉默），从体外到体内深入研究候选蛋白质群对细胞增殖、细胞周期调控的影响。结合信号通路的特异性抑制药物等分析目的基因表达干预后导致的新差异蛋白及所涉及的信号通路。采用TAP技术并结合质谱分析筛选和鉴定出差异蛋白的相互
14、作用蛋白或蛋白复合体。利用稳定同位素标记并结合高灵敏度的生物质谱鉴定技术，研究细胞核蛋白质和DNA片段上的修饰类型、修饰位点，阐明其信号转导机制及其在衰老过程中的功能。采用在体鉴定快速肿瘤细胞增殖、侵袭和转移的实验系统，提高甄别在细胞周期中调控异常增殖蛋白质群的效率。选择调控细胞异常增殖的代表性新蛋白，建立其与肿瘤病人的相关性。【课题四】研究Hippo信号通路调控细胞增殖和细胞凋亡的分子机理，揭示Hippo信号通路核心分子对基因组稳定性的调控机制，分析Hippo信号通路蛋白与微管结合蛋白的关系及其在调控细胞增殖和凋亡中的作用。在全基因组水平上通过干扰基因的表达（RNAi）筛选Hippo调节蛋白
15、质群，并结合微阵列分析鉴定Hippo通路新的靶基因集团；通过上位分析（epistasis）和IP-Western等方法在体内与体外研究Hippo通路组成分子间的动态互作；通过质谱分析鉴定蛋白修饰，特别是磷酸化修饰调控Hippo通路的分子及生物学意义；系统分析Hippo通路蛋白质组群在细胞内的定位情况及转位意义；分析CYLD和EB1等微管结合蛋白与有丝分裂、细胞增殖以及基因组稳定性之间的关系；通过蛋白共定位研究探讨Hippo通路与PTEN调节基因组稳定性的关系，从而探讨多细胞生物在细胞周期失调而发生遗传物质不稳定的情况下如何对细胞命运进行调节。各课题组还将充分利用课题组三具备的大型蛋白质鉴定分析
16、技术平台对更多参与维持基因组稳定性的蛋白质群进行大规模鉴定和分析。3. 可行性分析(1) 本项目的科研队伍以从事生物化学、分子生物学、细胞生物学、蛋白质组学、生物信息学等国家和部门重点实验室、教育部985创新平台为主体，集中了目前从事基因组稳定性和细胞周期调控相关蛋白质群研究的优势科研团队。其中，各课题负责人都是本领域的专家，亲自设计各自的课题并将指导项目的具体实施。(2) 本项目着眼于大规模蛋白质组（群）而非单个蛋白的研究。2007年10月召开的国际蛋白质组学组织大会标志着从大规模技术性研究向差异和动态组学研究的趋势。但迄今已有的技术几乎都限于检测和比较蛋白的累积量。课题三近期自主建立的SiLAD 技术对蛋白真正表达水平差异的测定提供了更敏感和更精密的手段，并且保持了高通量的能力。另一方面利用稳定同位素同时掺入细胞核蛋白质和DNA上新添甲基的系统研究方法已成熟地用于本课题相关模型的研究
