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1、项目名称：畜禽肌肉和脂肪发育的分子调控机制研究首席科学家：袁立 厦门大学起止年限：2009.1至2013.8依托部门：教育部一、研究内容 （一）项目的总体设想动物骨骼肌和脂肪细胞的分化、生长和组织发育的调控过程实际上是内在的遗传和表观遗传基础和外在的各种信号分子互作的结果。 目前在该研究中存在的主要问题包括：（1）对组织器官的发育学研究还多半停留在单个基因或单个分子调控作用的水平，从系统、多层次和调控分子之间网络联系开展的研究不足，因而不利于对组织器官的发育从整体和完整过程的角度解析其发育的分子机制；（2）一些调控层次，如表观遗传学、RNA、信号分子、内在代谢与微环境等层次上的研究尚属新兴，缺
2、乏深入研究的资料，因而难以客观把握组织器官系统发育多重控制的机制；（3）对骨骼肌和脂肪发育的研究大多集中在人和实验鼠上，由于有限的物种资源，难以从比较生物学角度全面揭示细胞分化调控网络的发生、发展机制。而且已有的研究多是针对骨骼肌和脂肪代谢疾病有关的发病机理，研究存在一定的局限性。（4）近年来，通过干细胞技术和基因敲除等手段，在大小鼠等经典模式动物的骨骼肌和脂肪发育研究方面取得了一系列的进展，揭示了控制干细胞分化及骨骼肌和脂肪发育的多种重要基因和调控通路。但在猪和鸡上，相应的手段和资料相对不足，尤其是猪、 鸡骨骼肌和脂肪的胚胎干细胞技术还不够成熟，因而多能胚胎干细胞分化为猪、鸡骨骼肌和脂肪前体
3、细胞的分子机制认识不足；其他模式动物大许多数据尚未在猪和鸡上印证，因而不够明了猪和鸡骨骼肌与脂肪发育机制的特点；骨骼肌和脂肪发育表观遗传学方面的研究尚属新兴，因而不能能解析猪和鸡品种品系发育差异的机制。（5）虽然转基因猪和鸡都有成功的报道，但技术方法尚未能达到实际生产应用的要求，也未见涉及针对调控发育基因方面的研究。本项目运用干细胞、功能基因组、非编码RNA、RNA和蛋白组学、信号传导等先进研究手段，采用比较生物学研究策略，分别从基因转录与转录后沉默、DNA与蛋白质修饰，外周信号转导通路等层次深入研究猪和鸡的肌肉和脂肪组织发生、细胞生长和分化过程中，DNA、RNA、蛋白质以及外周信号分子之间互
4、作的调控网络关系和系统发生机制，并在miRNA鸡的培育方面进行攻关，填补发育研究领域的一些不足，可望在猪和鸡等畜禽肌肉和脂肪发育的分子调控理论及其应用方面取得重要突破。基于上述设想，本项目重点解决下列关键科学问题：1、阐明骨骼肌和脂肪胚胎与成体干细胞自我更新和分化的表观遗传学和网络调控机制。着重解决猪、鸡多能胚胎干细胞的分离培养及其诱导向骨骼肌和脂肪细胞分化的技术问题，发掘猪和鸡的各种胚胎与成体干细胞向骨骼肌和脂肪分化过程不同阶段的标记性分子和重要功能基因，揭示这些基因在此过程中的功能与调控机制。2、阐明猪和鸡骨骼肌与脂肪组织细胞发生、分化和生长代谢的遗传、表观遗传及非编码RNA调控的分子机制
5、。在发掘控制猪和鸡骨骼肌与脂肪组织生长与分化重要功能基因和调控通经的基础上，着重解析这些基因的代谢与表观遗传学调控机制；系统分离鉴定与猪、鸡与骨骼肌和脂肪发育相关的非编码RNA，揭示其功能机制，3、阐明品系间骨骼肌和脂肪生长发育差异的分子遗传与调节机制。在阐明不同品种品系猪和鸡的发育规律的基础上，系统比较不同部位组织和品种品系间发育的遗传、表观遗传及非编码RNA调控的差异，揭示猪、鸡种系骨骼肌和脂肪发育特点的分子机制。4、探索miRNA鸡培育的新技术手段。 着重解决提高同源重组、抑制随机整合、去除冗余外源序列的理论与技术问题，构建新型高效的转基因鸡载体，研究改进转基因鸡的技术操作方法，提高转基
6、因鸡获得效率，研究利用 miRNA 对特定基因沉默效率控制技术，建立可用于生产实践的 miRNA鸡的培育技术方法。（二）项目的研究内容本项目将在前期工作的基础上对猪、鸡的肌肉和脂肪发育的分子调控机制展开系统深入的研究，突出表观遗传学的研究，解析猪、鸡的肌肉和脂肪发育关键基因的调控网络，着重研究猪、鸡品种品系肌肉和脂肪发育差异形成分子机制，提升品种资源的利用，重点攻关 miRNA鸡的培育技术方法。本项目的主要研究内容包括以下方面：1、研究与完善猪、鸡肌肉和脂肪胚胎干细胞和各种成体干细胞分离培养与诱导分化的技术体系。包括猪、鸡胚胎期肌肉始祖细胞（MPC）、间充质细胞、骨骼肌卫星细胞和脂肪成体干细胞
7、的体外培养及其自我更新和定向分化的技术方法。2、进行猪、鸡肌肉和脂肪干细胞自我更新与分化和猪、鸡肌肉和脂肪组织发生、生长过程中的分子标志、重要基因的分离鉴定，开展对猪、鸡肌肉和脂肪发育过程的重要基因及其调节通路的功能作用与分子机制研究。包括采用基因表达谱芯片、蛋白质组学等方法，分离鉴定在猪、鸡肌肉和脂肪干细胞分化与组织发育相关的新基因和分子；研究这些基因以及我们在前期工作中得到的相关基因在猪、鸡肌肉和脂肪发育过程中的功能作用及其调节通路。3、研究猪、鸡肌肉和脂肪干细胞分化与组织发育的表观遗传学机制。采用蛋白组学分析技术、Gel-shift技术和ChIP、Solexa测序、甲基化间区位点扩增（A
8、IMS）等技术，研究猪、鸡肌肉与脂肪细胞干细胞分化和组织发育过程中重要调控因子和功能基因的表观遗传学；研究内分泌、旁（自）分泌信号分子对骨骼肌和脂肪干细胞分化、融合（聚酯）的调控作用。4、研究非编码RNA在猪、鸡干细胞分化与组织发育的中的作用。包括在现有工作的基础上，分离鉴定与猪、鸡肌肉和脂肪发育相关的新miRNA，在猪和鸡的组织中，靶向克隆现已知在肌肉与脂肪发育中有调控的miRNA；研究这些miRNA的表达规律，验证其在猪、鸡肌肉和脂肪发育过程中的调节作用，鉴定其作用的靶向基因。5、研究不同品种（系）猪、鸡肌肉和脂肪发育差异形成的遗传与表观遗传学机制。采用比较生物学策略，系统研究不同猪种（瘦
9、肉型外来品种与脂肪型优质地方品种）、鸡种或品系（蛋用型和肉用型、高脂系和低脂系）肌肉与脂肪组织之间重要基因的单核苷酸多态性（SNP分布的数据库）、DNA和组蛋白修饰以及基因表达、miRNA等遗传学与表观遗传学差异。结合各品种猪、鸡不同类型和部位的肌肉与脂肪的生长发育规律，研究这些差异与这些重要经济性状的关系。6、研究miRNA鸡培育技术。研究提高同源重组、抑制随机整合、去除冗余外源序列的转基因鸡载体技术，研究提高转基因鸡获得效率的技术方法。利用 miRNA 对特定基因沉默效率控制的理论和技术，建立起可用于生产实践的 miRNA鸡的培育技术方法。二、预期目标 （一）总体目标凝聚发育生物学、分子生
10、物学和遗传学等学科领域的优秀科研团队，运用功能基因组、RNA和蛋白组学、代谢组学和信号传导等先进研究手段，采用比较生物学研究策略，分别从基因转录与转录后水平的各层次深入揭示猪、鸡肌肉和脂肪组织发生、细胞分化和生长发育过程中，DNA与蛋白质修饰、miRNA调控、外周信号等作用的调控网络关系和系统发生机制，从而阐明肌肉和脂肪生长发育的分子机制; 综合同源重组、miRNA与RNA理论与技术的进展，探索miRNA鸡的培育技术。力争在肌肉和脂肪发育生物学理论的基础研究与应用方面取得重大突破，为我国发育生生物学的发展搭建新的理论研究平台，组建创新型研究团队，整体提升我国本学科领域在国际学术界的地位，推动我
11、国自主创新型医学和畜牧科技的快速发展。（二）五年预期目标1、建立国内最完善的猪、鸡肌肉与脂肪的干细胞库，包括胚胎干细胞和不同组织来源的成体干细胞，建立猪、鸡肌肉与脂肪胚胎干细胞和2种以上成体干细胞诱导分化的优化技术。这一目标的实现将为本相目与国内将后的相关研究提供研究资源与技术方法。2、发掘一批猪、鸡胚胎期肌肉祖细胞（MPC），以及骨骼肌和脂肪成体干细胞（骨骼肌卫星细胞和脂肪前体细胞）自我更新和分化过程中的标志性分子与重要功能基因，阐明内分泌、旁（自）分泌信号分子调控其增殖和分化的跨膜信号转导通路，以及表观遗传修饰在此过程中的作用。这一目标的实现，将取得在猪、鸡肌肉和脂肪干细胞分化机制认识方面
12、的突破，提升我国在猪、鸡肌肉和脂肪干细胞方面的研究水平。3、建立猪、鸡骨骼肌和脂肪细胞的miRNA文库，获得猪、鸡骨骼肌和脂肪发育过程中miRNA表达的信息，阐明5种以上miRNA对体节发生和肌肉祖细胞与间充质细胞分化过程中关键基因的调控机制。miRNA文库将达到国内领先和国际先进水平，同时使我国在miRNA对猪、鸡骨骼肌和脂肪发育控制作用及其调控机制方面的研究进入国际先进行列。4、揭示猪、鸡肌肉和脂肪细胞分化与代谢过程中关键转录因子、转录辅助因子等关键基因的功能与作用机制，探讨DNA和组蛋白修饰对关键作用基因表达的影响，进一步阐明骨骼肌和脂肪发育与代谢的分子调控网络机制。这一目标的实现，将进
13、一步提高我们对猪、鸡肌肉和脂肪发育分子调控机制的深入认识，积累组织器官发育的新知识，为发育原理在畜牧生产与医学实践中的应用提供指导作用。5、揭示不同猪种（瘦肉型外来品种与脂肪型优质地方品种）、鸡种或品系（蛋用型和肉用型、高脂系和低脂系）肌肉和脂肪组织之间的遗传和表观遗传学分子差异及其与肉、脂性状形成的关系。这是发育领域的开拓性研究，这将丰富我们对发育分子机理的认识，将为我国猪、鸡品种资源的有效利用提供科学依据，增强我国畜牧生产的自主创新能力。6、建立可用于生产实践的miRNA鸡的培育的技术方法。这一目标的实现将是发育原理用于生产实践的重大突破，虽然本目标的实现存在一定风险，但至少将在转基因技术
14、方面取得一定突破，为旨在提高生产性能、抗病性能和作为生物孵化器的转基因鸡培育提供可借鉴的理论技术资料。 7、发表研究论文SCI论文40篇以上，其中在影响因子5.0以上国际主流杂志发表论文20篇左右。申请发明专利3-5项。8、打造一支高水平的科研队伍，培养一批博士研究生（20-25人），硕士研究生（40-60人），博士后研究人员（5-10人）。三、研究方案 （一）实现预期目标的总体研究思路项目研究的技术路线及可行性分析1、总体思路猪和鸡作为重要的模式生物和经济动物，近些年来对其遗传与发育学研究已取得了一些重大突破。猪和鸡基因组结构被逐步解析，一些与肌肉和脂肪发育调控相关的重要基因也已被发现。 实
15、际上，肌细胞和脂肪细胞的分化、生长与发育调控是一系列相关基因的时序性表达和关闭的结果，对这些基因调控网络的全面解析是后基因组时代的主要研究内容。目前，对猪、鸡肌肉和脂肪发育调控的研究主要集中在基因的结构、转录因子和分子标志的时序性表达，以及关键基因调控肌肉和脂肪分化和生长发育的功能揭示的研究，而对调控基因与调控因子产生“程序化”作用的过程及其分子机制尚不清楚，特别是：（1）对肌肉和脂肪细胞组织发生、生长发育和分化的基本控制通路中许多上下游和平行作用的分子及其关联尚待发掘，对局部微环境中各种内分泌和旁（自）分泌等信号分子如何通过细胞内特定信号转导通路调控细胞的分化、发育和代谢过程也缺乏深入和系统
16、的研究；（2）对肌肉和脂肪细胞分化过程中，DNA与组蛋白修饰等表观遗传学特征如何调控功能基因的转录， miRNA如何在此过程中对其基因表达的控制等方面的研究还刚刚起步；（3）品种（系）间猪和鸡肌肉和脂肪分化和生长发育差异的遗传学和表观遗传学基础的研究基本处于空白。 本项目针对上述问题展开研究，结合我们前期的工作基础，运用现代生物技术的先进方法，从胚胎期组织发生、细胞分化、出生后生长和发育等多阶段，在DNA、RNA、蛋白质等多层次上展开研究，期望在猪、鸡骨骼肌和脂肪发育调控的遗传学、表观遗传学与外周信号调控机制多方面取得重大突破，为推进我国发育生物学、比较医学和畜禽的遗传育种研究与实践奠定坚实理论与技术基础。2、技术路线建立猪、鸡肌肉和脂肪干细胞库和非编码RNA库，发掘猪、鸡肌肉和脂肪干细胞分化与组织发育的新功能基因和miRNA，在猪和鸡中靶向克隆在其他物种分离鉴定的肌肉和脂肪
