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1、项目名称：恶性肿瘤非编码RNA相关蛋白的功能网络与调控机制的研究首席科学家：宋尔卫 中山大学起止年限：2010年1月-2014年8月依托部门：教育部一、研究内容本项目拟解决的关键科学问题是“恶性肿瘤非编码RNA相关蛋白的功能网络和调控机制及其与肿瘤发生发展和治疗抗性的关系”，包括以下四个方面：1）新的肿瘤ncRNA及相关蛋白的发现和作用机制；2）肿瘤ncRNA转录、转运、加工及修饰过程中相关蛋白的功能；3）ncRNA相关蛋白在肿瘤发生发展中的作用；4）ncRNA相关蛋白与肿瘤治疗抗性的关系。围绕上述科学问题，本项目拟以我国常见的恶性肿瘤为疾病模型，研究肿瘤细胞内相关蛋白网络如何参与ncRNA的
2、生物合成与基因调控功能，并探索它们之间的相互作用对肿瘤细胞生物学行为的影响，以及与肿瘤发生发展和治疗抗性的关系。主要研究内容包括：1）建立和优化适合于肿瘤研究的ncRNA组学方法和ncRNA相关蛋白研究体系，筛选和鉴定一批新的肿瘤相关ncRNA及其相互作用蛋白；2）探索DNA甲基化和组蛋白修饰及转录因子对肿瘤ncRNA的转录调控，以及相关蛋白在ncRNA转运、加工及修饰过程中的作用；3）探讨ncRNA及其相关蛋白对肿瘤启动细胞自我增殖、分化方向和成瘤特性的调控机制，阐明其与肿瘤发生的关系。研究ncRNA及其相关蛋白在肿瘤发展过程中对肿瘤细胞EMT，肿瘤转移和血管生成的作用；4）研究ncRNA及
3、其相关蛋白调控肿瘤细胞凋亡、自噬的机制，解析常见恶性肿瘤中ncRNA及其相关蛋白对治疗抗性的影响。二、预期目标本项目的总体目标以常见的恶性肿瘤为模型，通过研究非编码RNA（ncRNA）相关蛋白的功能网络和调控机制，发现一批新的肿瘤ncRNA及相关蛋白并揭示其作用机制；阐明肿瘤ncRNA转录、转运、加工及修饰过程中相关蛋白的功能；解析ncRNA相关蛋白在肿瘤发生发展中的作用以及ncRNA相关蛋白与肿瘤治疗抗性的关系，使我国在恶性肿瘤ncRNA相关蛋白研究领域取得突破性进展，为我国在该领域培养一批优秀人才。 本项目的五年预期目标1建立适合于肿瘤研究的ncRNA相关蛋白的各种平台，包括适合于肿瘤研究
4、的ncRNA组学技术平台，肿瘤特异ncRNA相互作用蛋白质高通量筛选和分析技术平台；建立计算生物学和实验生物学有机结合的研究方法，系统分析和鉴定一批新的不同长度和不同类型肿瘤特异性ncRNA及相关蛋白，揭示ncRNA及相关蛋白的相互作用机制。2发现30-40个新的参与恶性肿瘤功能网络调节的ncRNA相关蛋白，包括参与肿瘤ncRNA基因的DNA甲基化、组蛋白修饰和转录，以及肿瘤ncRNA转运、加工及成熟修饰的相关蛋白；调节肿瘤启动细胞自我增殖、多向分化，成瘤能力等生物学特性的ncRNA相关蛋白；调节肿瘤细胞EMT和抗凋亡特性，以及肿瘤转移、血管生成和治疗抗性的ncRNA相关蛋白，为阐明恶性肿瘤n
5、cRNA相关蛋白功能网络和调控机制提供新线索。3. 阐明ncRNA相关蛋白在肿瘤发生发展和治疗抗性中的新的调控机制，包括肿瘤特异ncRNA相关蛋白的表观遗传调控机制，ncRNA相关蛋白对肿瘤启动细胞的调控机制，ncRNA相关蛋白对对肿瘤血管生成、以及肿瘤细胞迁移和EMT的调控机制，ncRNA相关蛋白对肿瘤细胞凋亡、自噬和治疗抗性的调控机制，深入研究10-20种左右具有临床意义的非编码RNA及相关蛋白，发现至少23条新的ncRNA相关蛋白参与的调控肿瘤发生发展和治疗抗性的信号转导通路，为人类认识肿瘤发生发展的分子机制和治疗癌症提供理论依据。4预计在SCI收录杂志发表论文80篇以上，其中IF5分以
6、上论文超过40篇，争取在Cell、Nature、Science等顶尖杂志上发表高水平论文，申请专利10-15个。5为我国在恶性肿瘤ncRNA相关蛋白研究领域培养一批高水平创新性人才，包括培养15-20名博士后等青年骨干人才，7080名博士生，100名硕士生，产生百篇优秀博士论文1-2篇。三、研究方案1.总体学术思路：以非编码RNA（ncRNA）相关蛋白调控网络在肿瘤发生发展与治疗抗性中的作用研究作为总体目标，本项目拟识别和鉴定一批肿瘤特异的ncRNA，筛选并确定参与它们在肿瘤细胞中异常表达及行使生物学功能的相关蛋白质。此外，探索ncRNA与相关蛋白之间的相互作用机制，及其对肿瘤细胞增殖、分化、
7、转移、凋亡和治疗抗性等的作用，最终阐明肿瘤非编码RNA相关蛋白调控网络系统及功能，为人类认识肿瘤发生发展的分子机制和治疗癌症提供理论依据。总体研究方案图示如下：ncRNA与调控其表达的蛋白相互作用识别和鉴定肿瘤ncRNA与相关蛋白ncRNA与行使其生物功能的蛋白相互作用ncRNA对靶蛋白的作用与肿瘤发生发展 与肿瘤治疗抗性解析肿瘤ncRNA表达的调控机制l 表观遗传机制对ncRNA表达的调控l 转录因子对ncRNA的调控l ncRNA合成、加工成熟与修饰过程及其与蛋白质相互作用的机理l 肿瘤启动细胞及其在各向分化过程中的ncRNA及相关蛋白的时空表达谱l ncRNA相关蛋白对肿瘤启动细胞的调控
8、与肿瘤发生l ncRNA相关蛋白对肿瘤血管生成的调控作用l ncRNA相关蛋白参与肿瘤细胞迁移、EMT和肿瘤转移的机制研究l 肿瘤细胞凋亡与自噬过程相关的ncRNA及相关蛋白的筛选与鉴定l ncRNA相关蛋白对肿瘤细胞凋亡和自噬过程的调控作用研究l ncRNA相关蛋白在纳米颗粒引发的癌细胞自噬中的功能l ncRNA相关蛋白对恶性肿瘤治疗抵抗作用的研究恶性肿瘤发生发展中的ncRNA及其相关蛋白调控网络 识别和鉴定新的肿瘤特异ncRNA及与其靶蛋白的作用机制 解析调控肿瘤ncRNA转录和加工修饰的蛋白质功能 阐明ncRNA相关蛋白对肿瘤启动细胞的调控作用与肿瘤发生的关系 揭示ncRNA相关蛋白对肿
9、瘤血管生成与转移的作用与肿瘤发展的关系 探索ncRNA相关蛋白对肿瘤细胞凋亡和自噬的作用与肿瘤治疗抗性的关系技术途径及可行性：本项目在总体目标的架构下分为4个主要的课题方向（见课题设置），各课题方向的主要技术途径总结如下：课题1：利用RNA组学研究方法，采用深度测序技术、DNA文库、基因芯片技术，高通量筛选和鉴定新的肿瘤相关ncRNA；采用基于生物质谱分析的蛋白质组学技术、酵母三杂交技术、SELEX技术、免疫沉淀-RNA:随机聚合酶链反应方法，以及CLIP(crosslinking and immunoprecipitation)方法、蛋白复合体分离检测技术，结合生物信息学技术，规模化地系统性
10、筛选、鉴定肿瘤特异性ncRNA相互作用蛋白，发现ncRNA与蛋白质相互作用规律。 课题2：通过DAC/TSA处理法结合MSP和ChIP法，筛选、鉴定受表观遗传调控的ncRNA；通过DNA亲和层析、ChIP-Seq、荧光素酶报告系统等方法在肿瘤细胞中检测转录因子与启动子的结合活性；通过免疫共沉淀、酵母三杂交、SELEX、CLIP等技术分离和鉴定与ncRNA结合蛋白；用筛选调控转录后加工关键蛋白的miRNA；应用用免疫共沉淀方法鉴定ncRNA修饰蛋白，如lin-28等和候选miRNA前体的结合及体外催化实验鉴定恶性肿瘤细胞系中ncRNA修饰蛋白介导的候选miRNA前体尿嘧啶化；应用测序技术对ncR
11、NA基因多态性进行分析。课题3：通过ncRNA芯片、ncRNA克隆和深度测序鉴定肿瘤启动细胞特异的ncRNA表达谱；通过生物信息学预测、蛋白组学、蛋白差异表达分析以及RNA干扰实验研究分离和鉴定ncRNA相关蛋白；通过平皿培养、三维Matrigel培养、免疫缺陷鼠移植瘤系统、ncRNA表达/拮抗实验研究ncRNA在肿瘤启动细胞中的生物学功能。采用划痕修复试验、转移小室（Transwell）的细胞迁移和侵润检测系统和荷瘤鼠转移模型等研究肿瘤转移能力；采用倒相性、荧光和共聚焦显微技术观察肿瘤细胞形态；采用小动物成像系统技术，动物外周学循环肿瘤细胞检测技术，组织学检测技术以及荧光定量PCR技术等检测
12、ncRNA干预对恶性肿瘤转移的作用；通过免疫组化和免疫细胞化学等检测转移细胞ncRNA相关的蛋白通路激活状态。课题4：通过亲和层析法、酵母三杂交系统、ChIP-RT-PCR等技术筛选和鉴定ncRNA相关的凋亡蛋白；应用 THF方法制备富勒烯纳米颗粒；用动态光散射、透射电镜、HPLC等技术测定纳米颗粒的粒径、表面电势、浓度及分散度等理化性质；通过荧光观察GFP-LC3聚集，western检测LC3-I向LC3-II的转化，电子显微镜观察自噬体及自噬溶酶体，western检测p62和Free GFP等进行自噬检测；通过检测细胞自噬特征性的GFP-LC3点状聚集，筛选自噬相关ncRNA；采用West
13、ern Blotting,免疫组化以及酶活性检测等手段研究ncRNA生成过程中的重要蛋白质如Drosha、Dicer以及Argonaute 2在细胞自噬过程中表达水平、分子形式以及细胞内定位可能的变化。本研究团队中有相当部分的研究人员具有多年从事肿瘤学或肿瘤学相关基础研究的科研经验，其中在Cell、Nature、Science、N Engl of Med系列杂志上发表的文章中与肿瘤相关的占60。各课题组建立了适合于肿瘤研究的ncRNA相关蛋白的实验平台和分析平台，包括上述绝大部分技术途径，建立了多种化学致癌物诱导人体细胞恶性转化的模型，建立了肿瘤启动细胞的研究平台以及富集肿瘤启动细胞的动物模型
14、和细胞模型，建立了多种肿瘤细胞抗性模型，这些均为本研究奠定了坚实的基础，保证了该项目的顺利进行。2.创新点与特色理论方面创新：（1）首次研究以ncRNA为核心的基因表达的蛋白质调控网络：本研究从ncRNA与蛋白质的相互作用入手，全面系统地解析以ncRNA为纽带的蛋白质功能网络对肿瘤的作用。一方面研究肿瘤细胞内调控ncRNA转录和加工的蛋白质功能，另一方面研究ncRNA与其相关蛋白组成的调控网络调节着肿瘤细胞编码蛋白质的癌基因和抑癌基因的表达，从而参与调节肿瘤细胞的多种生命现象。这一观点的提出与论证将为完善一个多通路、多层次的基因调控网络以解析恶性肿瘤的发生和发展机制奠定基础。（2）为恶性肿瘤的
15、治疗提供新靶点：肿瘤的发生发展涉及多个编码基因的变异，而细胞内源性的ncRNA-蛋白质调控网络可调节多种基因的表达，因此，改项目将为恶性肿瘤的治疗提供更稳定有效的抗癌靶点。此外，肿瘤启动细胞是肿瘤发生、复发和转移的根源，对化疗和放疗不敏感。本项目通过筛选决定肿瘤启动细胞分化和生长命运的ncRNA及其相关蛋白，不仅为治疗恶性肿瘤提供了新的靶点，还提供了合适的靶细胞群，这将成为新一代的肿瘤基因治疗手段。（3）为研究ncRNA相关蛋白调控肿瘤提供新的模型：本项目将着眼于恶性肿瘤内维持其生长的特殊细胞群肿瘤启动细胞，通过筛选、识别和鉴定参与调节恶性肿瘤启动细胞基因表达的ncRNA及其相关蛋白质，研究它
16、们对肿瘤启动细胞分化命运的调控作用，从而为ncRNA-蛋白质调控网络调节肿瘤发生发展的研究提供了一个动态的崭新的生物学模型。此外，最新的研究发现肿瘤细胞自噬与治疗抵抗有关，本研究通过分析自噬过程中ncRNA相关蛋白的功能，阐述其对肿瘤治疗抵抗的作用，为研究肿瘤治疗敏感性提供新模型。（4）在部分交叉研究领域进行首次研究：有关ncRNA及其相关蛋白调控肿瘤治疗抗性的研究在国际上才刚刚展开，目前尚缺乏系统和深入的研究；此外，目前文献中尚未有ncRNA相关蛋白调控细胞自噬的报道，结合课题组温龙平教授团队首次发现的纳米颗粒可以通过ncRNA调控细胞自噬，为纳米生物学及纳米安全性研究提供新线索。技术方法创新：（1）RNA组学平台在肿瘤特异ncRNA筛选中应用：本研究将采
