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1、为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划质粒dna的提取实验报告实验一、质粒DNA的提取及检测【实验目的】1、掌握碱裂解法提取质粒的原理和步骤2、掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术3、学会PCR操作的基本技术第一部分质粒DNA的提取一、实验原理：碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入的乙酸钾高盐
2、缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。二、仪器与试剂1、仪器恒温摇床、台式离心机2、试剂溶液I、溶液、溶液、无水乙醇、TE缓冲液、胰RNA酶、酚、氯仿三、实验步骤1、将2mL含相应抗生素的LB液体培养基加入到试管中，接入含pUC19质粒的大肠杆菌，37振荡培养过夜。2、取培养物倒入微量离心管中，4000r/min离心2min。3、吸去培养液，使细胞沉淀尽可
3、能干燥。4、将细菌沉淀悬浮于100L溶液I中，充分混匀，室温放置10min。5、加200L溶液，盖紧管皿，混匀内容物，将离心管放冰上5min。6、加入150L溶液，盖紧管口，颠倒数次使混匀。冰上放置15min。7、1XXr/min，离心15min，将上清转至另一离心管中。8、向上清中加入等体积酚：氯仿，反复混匀，1XXr/min，离心5min，将上清转移到另一离心管中。9、向上清加入2倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置510min。1XXr/min，离心5min。倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。10、用1mL70乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干燥。
4、11、加20LTE缓冲液，其中含有20g/mL的胰RNA酶，使DNA完全溶解，-20保存。第二部分琼脂糖凝胶电泳检测DNA一、实验原理：DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对
5、分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。如实验提取的pUC19质粒，有3种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒DNA，开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA1条链断裂，线状质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA2条链发生断裂。这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同。因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。二、仪器与试剂1、仪器琼脂糖凝胶电泳系统、紫外线透射仪、电炉子2、试剂5TBE、凝胶加样缓冲液、琼脂糖、溴化乙锭溶液三、实验步骤制备琼脂糖凝胶称取琼脂糖，放入锥形瓶中，加入10mLTBE缓冲液，加热至完全溶化，
6、摇匀，则为1琼脂糖凝胶液。胶板的制备1、取有机玻璃内槽，洗净，晾干。2、将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。3、将冷到60左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面。4、待胶凝固后，取出梳子，放在电泳槽内。5、加入电泳缓冲液至电泳槽中。加样用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品加入加样孔。电泳1、接通电泳槽与电泳仪的电源。2、当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿12cm处，停止电泳。四、实验结果在紫外灯下观察染色后的电泳凝胶。DNA存在处应显出桔红色荧光条带。第三部分PCR扩增制备目的基因一、实验原理：是将待扩增的DNA模板加热变性，与其两侧互补的寡聚核苷
7、酸引物复性，然后经过耐热的DNA聚合酶延伸。经过变性复性延伸的n次循环后，DNA可被扩增2n倍。二、仪器与试剂1、仪器PCR仪2、试剂模板DNA、TaqDNA聚合酶、引物、10Buffer、DNAMarker三、实验步骤加样：在PCR微量离心管中配制25l反应体系。ddH2Ol10PCRldNTPl10mol/Ll10mol/Ll模板DNAl总体积25l将PCR反应体系混匀，按以下循环条件在基因扩增仪上进行PCR循环：预变性945min变性9445s退火5645s延伸7245s完全延伸723minPCR结束后，取10l产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。四、实验结果：质粒DNA的提取一、实验方法碱裂解
8、法抽提质粒DNA二、实验原理基于质粒DNA与染色体DNA变性与复性的差异。三、实验步骤1）质粒提取1.10,000g,1min离心收集5ml菌液沉淀于离心管中。2.加入100?l溶液1，振荡至彻底悬浮。3.加入200?l溶液2，立即轻柔颠倒离心管6次，使菌体充分裂解，随后将离心管冰上放置3分钟4.加入150?l溶液3，立即温和颠倒离心管数次，冰上放置3分钟，10，000g离心10min。5.将步骤4的上清转移至新的离心管，加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合均匀10，000g离心5min。6.将步骤5的上清转移至新的离心管，加入2倍体积的无水乙醇，室温放置510min，沉降DNA7.10，000
9、g离心10分钟,弃乙醇，保留沉淀，加入1ml70的乙醇洗涤沉淀，10，000g离心5分钟8.倒掉乙醇溶液，用吸水纸吸净管壁上的水珠，室温蒸发痕量乙醇9.加入适量含RNase的TE或灭菌双蒸水溶解质粒DNA2）质粒鉴定?琼脂糖凝胶电泳灌胶：胶中加入荧光染料(SYBRGreenI)加样：质粒+上样缓冲液?混匀电泳结果观察：UV灯下四、实验结果五、实验分析裂解细胞中除含有质粒DNA外，还含有基因组DNA、各种RNA、蛋白质和脂类等物质，因此用碱裂解法除去杂质1、防止DNA裂解：Solution11）、所含糖增加溶液黏度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切作用降解2）、所含EDTA抑制酶活性2、溶解与变
10、性：Solution21)强碱使质粒DNA和染色体DNA变性2）离子型表面活性剂SDS可溶解膜蛋白3、沉降与复性：Solution31)质粒DNA复性2）在钾盐中，染色体DNA形成缠连的不溶性网状结构，和不稳定的大分子RNA以及变性的蛋白质和细菌碎片等一起沉淀预期结果为剩余质粒DNA4、琼脂糖凝胶电泳1）荧光染色染料分子可嵌入双链DNA分子配对碱基之间2）琼脂糖可起到电泳和分子筛的作用，因所带电荷、分子量大小和构型不同，泳动速度不同六、误差分析实验失败，本组实验出现4条带，3明1暗，明亮处应为DNA分子数最多的，为质粒DNA，质粒DNA前有较暗的两条带，推测其中一条为未复性质粒DNA，可能So
11、lution2处变性过长，不易复性，或Solution3处时间过短，复性不充分。另一条，RNA-DNA杂交链？因染料分子可嵌入双链DNA分子配对碱基之间。因还有一条在亮带后，推测为染色体DNA，推测很大可能性是Solution3处时间过短，沉降不完全。1实验目的：通过本次实验学习和掌握碱裂解法提取质粒；通过本次实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术；2实验材料及用品实验仪器：恒温培养箱、恒温摇床、高速离心机、漩涡振荡器、超净工作台、高压灭菌锅、微量加样器、烧杯、量筒、玻璃棒、微波炉、天平、电泳梳子、电泳槽、电泳器、紫外灯3）、材料与试剂：溶液I：50mmol/L葡萄糖；25mmol/L三
12、羟基甲基氨基甲烷Tris-HCl；10mmol/L乙二胺四乙酸溶液I可成批配制，每瓶约100ml，10磅高压蒸气灭菌15分钟，贮存于4。溶液：新鲜配制，等体积混合/LNaOH；1%SDS注意：SDS易产生气泡，不要剧烈搅拌。溶液IIITE液缓冲液：10mmol/LTris-HCl；1mmol/LEDTA70%乙醇；平衡酚：氯仿1：1：将量取25mlTris-HCl平衡苯酚，加入24ml氯仿和1ml异戊醇，充分混合后，移入棕色玻璃瓶中，4保存。LB培养基：胰化蛋白胨10g酵母提取物5gNaCl15gpH琼脂糖；1liter5TBE备用溶液：54gtrisbase，硼酸，20mlmol/LEDTA
13、,pH；6凝胶加样缓冲液：%溴酚蓝，40%蔗糖；另外还有的试剂是：胰RNA酶、DNAMarker、硼酸、Gelview试剂实验材料：含有pUC19质粒的大肠杆菌等。3实验原理：1）质粒DNA的提取：关于质粒：质粒是一类存在于几乎所有细菌中染色体之外呈游离状态的双链、闭环的DNA分子。质粒通常携带有染色体上所不存在的能够表达产生抗生素、耐受重金属等重要性状的基因。细菌质粒的大小范围从1kb至200kb以上不等，且拥有自己的复制起始位点，可不依赖于染色体而进行独立自主复制。一些小的质粒利用宿主细胞的酶进行复制，而较大的质粒则自身携有复制与编码的有关酶。一般分离质粒DNA的方法都包括3个步骤：培养细
14、菌，使质粒DNA大量扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA的原理：碱裂解法提取质粒DNA是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。在pH值介于这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确；而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，因复性较缓慢且不准确而相互缠绕形成不溶性网状结构。而复性的质粒DNA恢复原来构型，保持可溶性状态。通过离心，染色体DNA
