为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划磷钨酸染色后材料是白色 磷钨酸用水或磷酸缓冲液配制成1％左右的溶液，用滴管一滴染色液在制好样品的铜网上，1～2分钟后，用剪成尖角的滤纸吸去染色液再滴一滴纯水在铜网上，用滤纸吸去，反复两三次，这样是为了洗去多余的磷钨酸，然后静置干燥然后就可以用电镜观察了 磷钨酸中的重原子相对于有机分子中的碳氢氧氮等轻原子来说，更能阻挡电子所以，有磷钨酸吸附的地方在TEM照片中看起来更黑，而有机物占据的地方看起来更亮之所以叫“负染色”，就是因为被染“黑”的是背景和外轮廓，真正感兴趣的样品部分是“白”的也就是说，典型的经过负染色的样品是表现为黑背景中的白区 一般有机物并不与磷钨酸发生反应，磷钨酸只是沉积在有机物周围形成“背景”或“轮廓”但是不是所有的磷钨酸染色都是负染色有一些羟基和酰胺类会与磷钨酸作用，出现正染色的效果，即有些含有这些基团的有机物在TEM下看起来被染“黑”，最典型的是尼龙 另外，有时候不成功的负染色，看到的结果也是“白底黑点”，其实虽然是做了染色的操作，但可能由于方法不对，或者样品本身的性质不适用负染色，结果跟没染是一样的。
如果有机颗粒足够大，不染色时就能看到“白底黑点” 另一方面，如果染色很弱，一般只是给有机颗粒镶上一个轮廓，如果染色剂量很大，则会出现很黑的“背景”因此，对于很小的有机颗粒，如果染色很弱，只是一个轮廓圈，电镜放大倍数不够的时候，看起来就是一个小黑点了就好像一个纸上画一个空心圈，站远了看也可能 成一个小黑点 负染色技术 负染色又称阴性染色，是相对于普通染色(称正染色)而言的负染色首先由Hall在1955年提出Hall在病毒研究中用磷钨酸染色后，发现图像的背景很暗，而病毒象一个亮晶的"空洞"被清楚地显示出来在超薄切片的染色中，染色后的样品电子密度因染色而被加强，在图像中呈现黑色而背景因未被染色而呈光亮，这种染色称为正染色而负染色则相反，由于染液中某些电子密度高的物质(如重金属盐等)"包埋"低电子密度的样品，结果在图像中背景是黑暗的，而样品像"透明"地光亮两者之间的反差正好相反，故称为负染色 对于负染色的机制目前还不十分了解对颗粒状的生物材料的研究而言，负染色技术与超薄切片方法相比具有分辨率高(可达15Å)，简单快速等优点因此，在生物学研究中得到越来越广泛的应用它可以显示生物大分子、细菌、病毒、分离的细胞器以及蛋白质晶体等样品的形状、结构、大小以及表面结构的特征。
尤其在病毒学中，负染色技术成为不可取代的实验技术 [编辑] 负染色液的制备 用作负染色的负染色剂应具有： 较强的电子散射能力以产生足够的图像反差；熔点高，在电子束的轰击下不会升华；溶解度大，不易析出沉淀；在电镜下不呈现出可观察到的结构；分子小，容易渗入不规则表面的凹陷处；与样品不起化学反应等目前最常用的负染液是磷钨酸、磷钨酸钾和磷钨酸钠(分别简称为PTA、KPT、NaPT)此外醋酸铀、甲酸铀、硅钨酸、钼酸铵等也常作负染色剂用 它们的配制方法如下： 磷钨酸、磷钨酸钠、磷钨酸钾溶液通常用双蒸水或磷酸缓冲液配制成1％～3％的溶液，使用时应用1mol／L氢氧化钠溶液将负染色液的pH值调至～或实验所需的值醋酸铀：通常使用双蒸水配制成％～％水溶液()醋酸铀染色液应是新鲜的，最好使用前配制醋酸铀溶解需15～30分钟，在黑暗中能稳定几小时，使用前用1mol／L的氢氧化钠溶液将pH值调至甲酸铀：用双蒸水配制成％～1％水溶液，pH值为，使用时用1mol／L的氢氧化钠溶液将pH值调至～钼酸铵：用双蒸水配制成2％～3％水溶液，使用时用醋酸铵将pH值调至～钼酸铵对有界膜的生物材料具有特别良好的染色值。
[编辑] 染色方法 悬滴法用一根细滴吸管吸一滴样品悬液滴在有膜的铜网上，滴样时要防止铜网被液体吸到管上来或翻转而被污染如果用Formvar膜时，在制好膜后，可以直接在粘于滤纸上的铜网进行负染色操作如果用碳膜时，要用镊子夹着铜网，滴液后静置数分钟，然后用滤纸从铜网边缘吸去多余的液体，滴上负染色液，染色1～2分钟用滤纸吸去负染色液，再用蒸馏水滴在铜网上洗1～2次，用滤纸吸去水，待干后可用于电镜观察干燥时，由于表面张力的作用，某些敏感的材料可能受到损伤，可用戊二醛或四氧化锇预固定预固定在滴样之后进行 喷雾法将染色液和悬液样品等量混合，用特制的喷雾器喷到有膜的铜网上，待干后可用于电镜观察喷雾法的优点是雾滴较小，分布均匀，不易凝结成块但操作较麻烦，溶液混合时易产生沉淀，并且需要耗费较多的样品和染色液，尤其容易造成病毒扩散，故此法不常用 负染色技术 负染色又称阴性染色，是相对于普通染色(称正染色)而言的负染色首先由Hall在1955年提出Hall在病毒研究中用磷钨酸染色后，发现图像的背景很暗，而病毒象一个亮晶的"空洞"被清楚地显示出来在超薄切片的染色中，染色后的样品电子密度因染色而被加强，在图像中呈现黑色。
而背景因未被染色而呈光亮，这种染色称为正染色而负染色则相反，由于染液中某些电子密度高的物质(如重金属盐等)"包埋"低电子密度的样品，结果在图像中背景是黑暗的，而样品像"透明"地光亮两者之间的反差正好相反，故称为负染色对于负染色的机制目前还不十分了解对颗粒状的生物材料的研究而言，负染色技术与超薄切片方法相比具有分辨率高(可达15?)，简单快速等优点因此，在生物学研究中得到越来越广泛的应用它可以显示生物大分子、细菌、病毒、分离的细胞器以及蛋白质晶体等样品的形状、结构、大小以及表面结构的特征尤其在病毒学中，负染色技术成为不可取代的实验技术 [编辑] 负染色液的制备 用作负染色的负染色剂应具有： 较强的电子散射能力以产生足够的图像反差； 熔点高，在电子束的轰击下不会升华； 溶解度大，不易析出沉淀； 在电镜下不呈现出可观察到的结构； 分子小，容易渗入不规则表面的凹陷处； 与样品不起化学反应等 目前最常用的负染液是磷钨酸、磷钨酸钾和磷钨酸钠(分别简称为PTA、KPT、NaPT)此外醋酸铀、甲酸铀、硅钨酸、钼酸铵等也常作负染色剂用 它们的配制方法如下： 磷钨酸、磷钨酸钠、磷钨酸钾溶液通常用双蒸水或磷酸缓冲液配制成1％～3％的溶液，使用时应用1mol／L氢氧化钠溶液将负染色液的pH值调至～或实验所需的值。
醋酸铀：通常使用双蒸水配制成％～％水溶液()醋酸铀染色液应是新鲜的，最好使用前配制醋酸铀溶解需15～30分钟，在黑暗中能稳定几小时，使用前用1mol／L的氢氧化钠溶液将pH值调至 甲酸铀：用双蒸水配制成％～1％水溶液，pH值为，使用时用1mol／L的氢氧化钠溶液将pH值调至～ 钼酸铵：用双蒸水配制成2％～3％水溶液，使用时用醋酸铵将pH值调至～钼酸铵对有界膜的生物材料具有特别良好的染色值 [编辑] 染色方法 悬滴法 用一根细滴吸管吸一滴样品悬液滴在有膜的铜网上，滴样时要防止铜网被液体吸到管上来或翻转而被污染如果用Formvar膜时，在制好膜后，可以直接在粘于滤纸上的铜网进行负染色操作如果用碳膜时，要用镊子夹着铜网，滴液后静置数分钟，然后用滤纸从铜网边缘吸去多余的液体，滴上负染色液，染色1～2分钟用滤纸吸去负染色液，再用蒸馏水滴在铜网上洗1～2次，用滤纸吸去水，待干后可用于电镜观察干燥时，由于表面张力的作用，某些敏感的材料可能受到损伤，可用戊二醛或四氧化锇预固定预固定在滴样之后进行喷雾法 将染色液和悬液样品等量混合，用特制的喷雾器喷到有膜的铜网上，待干后可用于电镜观察喷雾法的优点是雾滴较小，分布均匀，不易凝结成块。
但操作较麻烦，溶液混合时易产生沉 淀，并且需要耗费较多的样品和染色液，尤其容易造成病毒扩散，故此法不常用漂浮法 先将带有支持膜的铜网在悬液样品的液滴上漂浮(有支持膜的那面向下)，然后再在负染色液的液滴上漂浮在漂浮期间，样品和染色液被吸附在铜网的支持膜上，漂浮时间与悬滴法相近 [编辑] 操作中的注意事项 一个理想的负染样品的图像应是均匀的，在一万倍的放大倍率下，图像出现一些薄薄的染色斑块，其特点是没有明显的边缘，染色斑由中央向边缘由深到浅，有一个逐渐变化的过程，如同中国水墨画的润色一样在3～4万倍观察时则可见到反差良好而柔和的生物结构而与此相反，黑白截然分明，缺乏由浅到深的中间色调，或在明亮的载网上出现颗粒性团块，则是染色失败的表现因此，虽然负染色方法简单，但要获得理想的负染色效果和实验的重复性却不大容易下列因素在操作中需加以注意： 悬液样品的纯度 待染色的悬液样品虽然不要求很纯，但如果杂质太多，如大量的细胞碎片，培养基残渣，糖类以及各种盐类结晶的存在将会干扰染色反应和电镜的观察尤其是不要有过多的糖类，因为在电子束的轰击下，糖类容易碳化而有碍观察，因此最好进行适当的提纯 悬液样品的浓度 样品悬液的浓度要适中，否则太稀时在电镜下寻找样品将很困难；太浓时，样品的堆集会影响观察。
因此第一次制样时，同时用几种浓度的样品进行滴样，从而采用浓度适中的铜网进行观察一般负染色技术通常要求每份样品至少含有10^7/ml目标颗粒，才能被观察到样品和染色液的均匀分布问题 生物大分子样品或病毒样品最好使用碳膜作支持膜使用其它支持膜，在电镜观察时往往会发生样品漂移，而不容易拍摄到好的照片但是由于碳膜的疏水性会使样品及染色液凝集，在电镜观察时往往由于样品和染色剂浓密的堆集而无法看清样品的结构细节为了提高染色效果，需要设法促进样品和染料的均匀分散，可采用以下方法： {使用分散剂}常用分散剂有牛血清蛋白(BSA)，适用于高度纯化的颗粒性悬液方法是把％～％牛血清蛋白溶液加到样品悬液内，所加量无严格的规定，先加数滴，如果仍不见效可适当增加；也可以直接用％BSA作为离心沉淀物的稀释液此外，也可以用杆菌肽，按30～50μg／ml的浓度用蒸馏水配制成溶液，用作沉淀物的稀释液或将样品悬液，PTA和杆菌肽溶液三者等量混合后滴样 {亲水性处理}对碳膜进行亲水性处理方法如下：把覆盖在铜网上的碳膜放在离子溅射仪中，在10Pa～1Pa的真空中用离子轰击(蚀刻)几秒钟，碳膜即由疏水性变为亲水性用这种碳膜就不存在样品与染色剂凝集的问题。
但要注意碳膜经亲水性处理后，经过1～2天又会变为疏水性的，因此最好亲水性处理后立即使用 样品悬液和染色液的酸碱度问题 样品悬液和染色液的酸碱度会对负染色的结果产生较大的影响为了确保生物样品有足够的缓冲条件，一般用2％醋酸铵或硫酸铵作缓冲液效果较好，并且使悬液的酸碱度呈中性或稍偏酸为宜 染色液的酸碱度不仅影响到染色液的扩散，而且会对病毒的形态造成一定影响负染色在制备过程中只要pH值有微小的变化就可能产生不同的形象，有时不仅不能获得良好的负反差，相反会出现正染色的效果某些负染色剂及其pH的参考值见表： 某些负染色剂及其pH参考表负染色剂浓度pH值缓冲液 磷钨酸钾2~醋酸铵 醋酸铀~1~无 甲酸铀~1~无 钼酸铵2~3~醋酸铵 钨酸锂2~醋酸铵 硼酸钨钠2~无 不同的样品要求不同的pH值，因此，在具体应用时，不要生搬硬套，而应当做必要的摸索 [编辑] 染色的时机 染色的时机十分重要滴染色液的时机一般既不要在生物样品完全干了之后，更不应在载网上尚有肉眼可见的水珠时就着手染色恰当的时机应是用滤纸吸去悬液之后稍待片刻，当肉眼看不出残留的液体时滴加染色液如果载网上尚有悬液残存伟哥.西力士.艾力达.上海公兴搬场.上海大众搬场.夫妻用品.性保健。