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1、为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划碱性磷酸酶比活性测定实验报告实验名称碱性磷酸酶的分离纯化、比活性测定与动力学分析实验日期XX年10月25号实验地点生化实验室合作者指导老师总分教师签名批改日期碱性磷酸酶是一种底物特异性较低，在碱性条件下能水解多重磷酸单脂化合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。AKP具有磷酸基团转移活性，能将底物中的磷酸基团转移到另一个含有羟基的接受体上，如磷酸基团的接受体是水，则其作用就是水解。AKP最适范围为.，动物中AKP主要存在于小肠粘膜、肾、骨骼、肝脏和胎盘等组织的细胞膜上。血清AKP主要来自肝
2、，小部分来自骨骼。AKP可从组织中分离纯化，也可以采用基因工程表达的方式获得：将碱性磷酸酶基因克隆到重组载体，转入宿主菌中进行重组表达，并从表达菌提取，并进行酶动力学分析。一实验原理1、碱性磷酸酶的分离纯化AKP分离纯化的方法与一般蛋白质的分离纯化方法相似，常用中性盐盐析法、电泳法、色谱法、有机溶剂沉淀法等方法分离纯化。有时需要多种方法配合使用，才能得到高纯度的酶蛋白。本实验采用有机溶剂沉淀法从兔肝匀浆液中提取分离AKP。正丁醇能使部分杂蛋白变性，过滤除去杂蛋白即为含有AKP的滤液，AKP能溶于终浓度为33%的丙酮或30%的乙醇中，而不溶于终浓度为50%的丙酮或60%的乙醇中，通过离心即可得到
3、初步纯化的AKP。2、碱性磷酸酶的比活性测定根据国际酶学委员会规定，酶的比活性用每毫克蛋白质具有的酶活性来表示，单位来表示。因此，测定样品的比活性必须测定：a每毫升样品中的蛋白质毫克数；b每毫升样品中的酶活性单位数。酶的纯浓度越高酶的比活性也就越高。本实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。酚在碱性条件下与4-氨基安替比作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。于510nm处比色，即可求出反应过程中产生的酚含量，而碱性磷酸酶的活性单位可定义为：在37摄氏度保温15min每产生1mg的酚为一个酶活性单位。样品蛋白质含量测定用Folin-酚法测定
4、。3、底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响在环境的温度、和酶的浓度一定时，酶促反应速度与底物浓度之间的关系表现为反应开始时。酶促反应的速度随底物浓度的增加而迅速增加。若继续增加底物浓度，反应速度的增加率将减少。当底物浓度增加到某种程度时，反应速度就会达到一个极限值，即最大反引发速度。底物浓度与酶促反应速度的这种关系可用米氏方程式表示：式中：Vmax为最大反应速度；S为底物浓度；Km为米氏常数；V代表反应的起始速度。当=Vmax/2时，Km=S。因此，Km等于酶促反应速度达最大值一半时的底物浓度。Km是酶的最重要的特征性常数，测定Km值是研究酶动力学的一种重要的方法，大多数酶的Km值在/L。Km和Vm
5、ax的测定：主要采用Lineweaver-Burk双倒数作图法。此式为直线方程，以不同的底物浓度1/S为横坐标，以1/V为纵坐标，并将各点连成一直线，向纵轴方向延长，此线与横轴相交的负截距为-1/Km，由此可以正确球的该酶的Km值。方程式与图如下：本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同底物浓度时的酶活性，再根据Lineweaver-Burk法作图计算其Km值。实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。酚在碱性条件下与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。根据吸光值得大小可以计算出酶的活性，也可以从标准曲线上差得酚的含量，进而算出酶
6、活性的大小。二、实验材料碱性磷酸酶的分解纯化和比活性测定、样品兔肝、试剂/L乙酸镁溶液/L乙酸钠溶液/L乙酸镁/L乙酸钠溶液/LTris/L乙酸镁PH.缓冲液丙酮95%乙醇正丁醇/L底物液mg/ml分标准液/L?%4氨基安替比林?%铁氰化钾?/mL蛋白标准液?碱性铜试剂?酚试剂、仪器与器材研钵刻度离心管刻度吸管电动离心机玻璃漏斗和玻璃棒托盘天平恒温水浴可见分光光度计底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响、样品兔肝匀浆液、试剂/L底物液mol/L碳酸盐缓冲液PH10碱性溶液%铁氰化钾%4氨基安替比林酚标准液、仪器与器材恒温水浴锅可见光分光光度计三、实验步骤AKP的提取AKP提取实验步骤(二)AKP的比活
7、性测定1、AKP的活性测定AKP活性测定实验步骤2、蛋白质含量测定蛋白质含量测定实验步骤底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响1、底物浓度对酶促反应速度的影响将新鲜兔肝用/L碳酸缓冲液匀浆，按20倍稀释即可酶曲线绘制步骤2、酚标准曲线的绘制的绘制酚标准曲线的绘制的绘制步骤碱性磷酸酶的提取及其比活性测定实验报告班级：12级生物一班小组成员：陈明珠、邓家颖、范洁婷、梁彦珺指导老师：许华本实验采取有机溶剂沉淀法从猪肝匀浆液中提取分离碱性磷酸酶(AKP)。正丁醇能使部分杂蛋白变性，过滤除去杂蛋白即为含有AKP的滤液，AKP能溶于终浓度为33的丙酮或30的乙醇中，而不溶于终浓度为50的丙酮或60的乙醇中，通过离
8、心即可得到初步纯化的AKP。根据国际酶学委员会规定，酶的比活性(specificactivity)用每mg蛋白质具有的酶活性单位(u/mgpr)来表示。因此，测定样品的比活性必须测定：(1)每ml样品中的蛋白质mg数(mg/m1);(2)每ml样品中的酶活性单位数(u/ml)。酶的纯度越高酶的比活性也就越高。本实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。酚在碱性条件下与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。于510nm处比色，即可求出反应过程中产生的酚含量，而碱性磷酸酶的活性单位(King-Armstrong法)可定义为：在3
9、7保温15min每产生lmg的酚为一个酶活性单位。样品中蛋白质含量测定用考马斯亮蓝法测定。2、实验试剂1/L乙酸镁溶液：称取乙酸镁溶于蒸馏水中，稀释至1000ml。2/L乙酸钠溶液：称取乙酸钠溶于蒸馏水中，稀释到1000ml。3/L乙酸镁-/L乙酸钠溶液：取/L乙酸镁溶液20ml及/L乙酸钠溶液100ml，混合后加蒸馏水稀释到1000ml。4/L/L乙酸镁缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷，用蒸馏水溶解并稀释至1000ml，即为/LTris溶液。取/LTris溶液100ml，加蒸馏水约800ml，再加/L乙酸镁溶液20ml，混匀后用1乙酸调pH至，用蒸馏水稀释至1000ml即可。5丙酮(分析纯)69
10、5乙醇(分析纯)7正丁醇(分析纯)8/L底物液：称取磷酸苯二钠(C6H5PO4Na22H2O)或磷酸苯二钠(无结晶水)，用煮沸冷却的蒸馏水溶解，稀释至1000ml。加氯仿4ml盛于棕色瓶中，冰箱内保存，可用一周。9/ml酚标准液：称取重蒸酚l00mg，用Tris液配制成100ml，临用前稀释100倍。10/LNaOH114-氨基安替比林：称取4-氨基安替比林及碳酸氢钠，用蒸馏水溶解并稀释至100ml，置棕色瓶中冰箱保存。12铁氰化钾：称取铁氰化钾5g和硼酸15g，各溶于400ml蒸馏水中，溶解后两液混合，再加蒸馏水至1000ml，置于棕色瓶中，暗处保存。1研钵2刻度离心管3移液管4电动离心机5
11、玻璃漏斗和玻棒6托盘天平7恒温水浴8石英比色皿型分光光度计3、操作步骤AKP的提取(1)取2g新鲜猪肝，剪碎后加入/L乙酸镁-/L乙酸钠溶液，研磨成匀浆。将匀浆倒人刻度离心管中，记录其体积VA，此为A液。吸取A液于另一试管A1中，加缓冲液稀释，此为稀释A1液(1：20)，供测比活性用。再取A液于另一试管A2中，加生理盐水稀释，此为稀释A2液，此供测蛋白质含量用。(2)在剩余A液中加入正丁醇，用玻棒充分搅拌2至5min，室温放置30min，用滤纸过滤，滤液置于刻度离心管中，加入等体积的冷丙酮，立即混匀后离心(XXr/min)5min，弃上清液，沉淀加入/L乙酸镁，用玻棒充分搅拌使其溶解，记录其体
12、积VB，此为B液。取B液于另一试管中，加人Tris缓冲液，此为稀释B液(1：20)，供测比活性用。再取B液于另一试管B2中，加生理盐水稀释，此为稀释A2液，此供测蛋白质含量用。剩余B液记体积VB。在剩余B液中加入96%的冷乙醇，混匀，离心5min，弃沉淀。上清液入离心管，记体积VB”，加VB”96%冷乙醇，混匀，离心2500rpm，5分钟。弃上清，沉淀加Mg(Ac)2-MNaAc混合液4ml，搅拌，记体积VC，此为C液。吸取C液于另一试管C1中，加缓冲液稀释，此为稀释C1液(1：10)，供测比活性用。再取C液于另一试管C2中，加生理盐水稀释，此为稀释C2液，此供测蛋白质含量用。剩余C液记体积V
13、C。(4)在剩余C液中加入冷丙酮，混匀，离心5min，弃沉淀。上清液入离心管，记体积VC”，加1/3VC”冷丙酮，混匀，离心XXrpm,5分钟。弃上清，沉淀加Mg(Ac)2-MNaAc混合液5ml，搅拌，记体积VD，此为D液。吸取D液于另一试管D1中，加缓冲液稀释，此为稀释D1液(1：10)，供测比活性用。剩余D液入D2管，直接待测蛋白质含量。AKP的比活性测定(1)AKP的活性测定：取试管5支，按表1操作：试剂mlB1234B1稀释液C1稀释液D1稀释液L底物液/L%4-氨基安替比林立即混匀，37水浴预温15min%铁氰化钾混匀，终止酶促反应，室温放置10min后，B管试剂调零，510nm管
14、OD。做一只酚标准管：依次加入缓冲液、/ml苯酚标准液、/LNaOH、%4-氨基安替比林。混匀，510nm处测吸光度。(2)蛋白质含量测定：取3支试管，按表2操作：表2A2稀释液B2稀释液C2稀释液D溶液考马斯亮蓝试剂混匀。2分钟后，B管试剂调零，595nm处测吸光度，记录各管OD。用牛血清蛋白制数只不同浓度的标准蛋白溶液，用考马斯亮蓝法测得其分光光度，并得到标准曲线表。4、计算方法测定管的吸光度1)每ml待测酶液中AKP活性单位数标准管的吸光度稀释倍数2)待测酶液中蛋白质浓度(mg/m1)=查标准曲线表所得值稀释倍数每ml待测酶液中AKP的活性单位数3）AKP的比活性(U/mg)=每ml待测酶液中蛋白质的毫克数4）总蛋白量(mg)=蛋白质浓度(mg/ml)总体积(ml)5）酶总活性单位数(U)=AKP活性单位数(U/ml)总体积(ml)6）纯倍数计算=各阶段AKP比活性数(U/mg)A液的AKP比活性数(U/mg)7）得率(%)=各阶段酶的总活性单位数(U)A液中酶的总活性单位数(U)100%5、实验结果测得表一各管OD值如下：苯酚标准管测得吸光度为表二各管OD值如下：标准蛋白曲线得出y=+，其
