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1、为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划真核微生物观察及筛选实验报告实验报告实验一显微镜的使用与微生物形态观察一、实验目的：1、学习并掌握油镜的原理和使用方法2、观察各种细菌的形态，并学会绘图二、实验原理：1、油镜的工作原理：普通光学显微镜的物镜通常有低倍物镜、高倍物镜、和油镜三种、2、基本原理：用油镜观察标本、是在使用高倍镜的基础上，采用同玻璃折射光相似的油状物，滴加在标本与油镜中间，以避免光线散射，提高显微镜的清晰度和分辨能力。是观察物象更加清楚明了。三、实验器材：1、菌种：细菌三型图片、酵母菌涂片、青霉菌涂片、大肠杆
2、菌等。2、溶液或试剂：香柏油、少量乙醚和无水乙醇的混合液3、仪器：普通光学显微镜、檫镜纸等。四、操作步骤：1、观察前的准备2、低倍镜观察3、高倍镜观察4、油镜观察五、绘图1大肠杆菌：2、葡萄球菌：3、青霉菌北方民族大学学生实验报告院生物科学与工程学院姓名学号专业生物工程班级同组人员课程名称微生物学类实验实验名称产酶微生物的分离、纯化与选育实验日期批阅日期成绩教师签字北方民族大学教务处制产酶微生物的分离、纯化与选育实验意义：酶是生物体内进行生物化学反应的催化剂，在生物体中已发现的酶有2500多种。由于酶促反应的特异性强，反应温和，安全无毒，环境污染少，在洗涤剂、皮革、纺织、诊断、制药等领域具有广
3、泛的应用价值。能由工业生产的50多种酶制剂蛋白酶、淀粉酶等，大部分是由霉菌、细菌、链霉菌和酵母菌生产的。通过本实验，学会从自然界中分离产酶微生物的方法，军中的纯化技术及其高产菌的选育技术。1.蛋白酶产生菌的分离与纯化实验目的：学习从自然界中分离蛋白酶产生菌并纯化。实验原理许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌。本实验将土壤样品悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到酪蛋白平板进行培养，根据酪蛋白平板的水解圈作初筛。也可直接将细菌或霉菌接种到酪蛋白平板进行培养，分离筛选其他蛋白酶产生菌。实验仪器与材料土壤样品或其他富含蛋白质的样品、牛
4、肉膏蛋白胨培养基平板、酪蛋白平板、无菌水、芽孢染色液；显微镜、恒温水浴锅、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、量筒等。实验方法与步骤配制酪素培养基：牛肉膏、NaCl，酪素，琼脂，蒸馏水100mL左右，调节pH。配制方法：称取酪素1g，先用少量2%NaOH润湿，玻璃棒搅动，再加适量的蒸馏水，在沸水浴中加热并搅拌，至完全溶解，补足水量至100mL，加入其他成分，调整pH值，灭菌备用。配制土壤样品：1）采集土壤样品，用无菌水制备1：10土壤悬液。2）取1：10土壤悬液5ml，然后将悬液按10、10、10、10梯度稀释，注入试管中。-1-2-3-43）将这些试管放入75-80水浴中热处理1
5、0min，以杀死非芽孢细菌。灭菌与接种：1）将培养基灭菌处理。2）取加热处理过的土壤悬液100-200L，涂布接种到酪素培养基平板，将平板倒置，于30-32培养24-48h。蛋白酶产生菌的纯化：1）根据酪蛋白平板的水解圈作初筛，挑选出单菌落的蛋白酶产生菌。2）将挑选出的单菌落用平板划线法接种到牛肉膏蛋白胨培养基上，然后将平板倒置放于培养箱中2448h。芽孢杆菌的染色判断1）挑去菌落涂片固定。2）滴加12滴孔雀绿染液于已固定的涂片上。3）用木夹夹住载玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但勿沸腾，切忌使染液蒸干，必要时可添加少许染液4）倾去染液，待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再褪色为止。5）用番红水溶液复染
6、1分钟，水洗至水为无色。6）待干燥后，置油镜观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色。蛋白酶产生菌的保存培养：1）用斜面划线法，取纯化鉴定后的菌种接种于斜面上，放于培养箱中2448h。2）将培养后的菌种置于冰箱中保存。实验结果：在含酪蛋白的平板上，产蛋白酶的芽孢杆菌可形成蛋白质水解圈。自然界中分离的微生物各菌株间产蛋白酶活力有很大差异，有些芽孢杆菌酶活力超过4000U/mL。1）描述你所分离的蛋白酶产生菌的菌落特征和个体形态特征；答：第一组：A:原液培养基表面出现大面积菌落，难以挑出所需单一菌落；B:10培养基表面菌落较多，但未发现与所需菌落相关特征；C:10培养基表面基本未出现菌落：D:10、10均发现
7、与所需菌落特征相符的菌落，继续培养待进一步纯化。第二组：A：原液培养基表面出现大面积菌落，难以区分-2-3-4-1B:10培养基表面基本未出现菌落C:10培养基表面基本未出现菌落：D:10、10培养基表面均发现与所需菌落特征相符的菌落，继续培养待进一步纯化2）报告你所分离的蛋白酶产生菌的初筛结果。答：求的平均HC值=-1-2-4-3注意事项1）土壤悬液加热处理的温度和时间应准确控制；2）点接含酪蛋白的平板时，接种量及接种面积要基本相同。分析与讨论在酪蛋白平板上水解圈与菌落直径比值大的菌落，其蛋白酶活力不一定大，因此，对初筛选出的水解圈与菌落直径比值大的菌落要进行发酵培养，进一步对发酵液进行酶活
8、力测定。思考题1）对所筛选的菌株如何进一步提高酶活力？请写出设想和方案；答：选用蛋白酶产量较高的原始菌种，扩大培养后，采用低浓度的菌悬液，进行紫外线时间梯度照射，选取一个突变率较高，成活率也较高的时间，大批量的进行紫外照射诱变，然后在明胶固体培养基平板上筛选水解圈较大的菌株接种，培养后测定水解酶活性，进一步筛选出高产菌株。2）蛋白酶有哪些方面的应用。答：蛋白酶广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。微生物蛋白酶，主要由霉菌、细菌，其次由酵母、放线菌生产。2.产酶微生物菌种的选育生物的遗传信息的改变是通过基因突变、基因重组和基因转移来进行的。基因突变，又称点突变，包括自发突变和诱发突变，前
9、者是未经人为施加诱变剂处理而发生的突变，后者是经人为施加诱变剂处理而获得的突变。两种突变都是由于一个或几个碱基的增加、缺失或置换而引起的，因此本质相同，不同的只是诱发突变的频率比自发突变的频率要高得多。这一部分的实验是以紫外线为例介绍了物理因素对微生物的诱变作用。本实验中，学生将筛选出的蛋白酶的产生菌株作为出发菌株通过紫外线即物理因素对微生物的诱变作用，对以上菌株进行选育工作。特以蛋白酶产生菌株作为出发菌株，经过紫外线的诱变作用，根据透明圈直径与菌落直径的比值，可初步确定蛋白酶的高产菌株为例来介绍本实验内容。实验目的通过实验观察紫外线和亚硝基胍等理化因素对微生物的诱变效应，并掌握基本方法。实验
10、原理基因突变可分为自发突变和诱发突变。许多物理因素、化学因素和生物因素对微生物都有诱变作用，这些能使突变率提高到自发突变水平以上的因素称为诱变剂。紫外线是一种最常用的物理诱变因素。它的主要作用是使DNA双链之间或同一条链上两个相邻的胸腺嘧啶间形成二聚体，阻碍双链的分开、复制和碱基的正常配对，从而引起突变。紫外线照射引起的DNA损伤，可由光复活酶的作用进行修复，使胸腺嘧啶二聚体解开恢复原状。因此，为了避免光复活，用紫外线照射处理以及处理后的操作应在红光下进行，并且照射处理后的微生物放在暗处培养。本实验分别以紫外线作为单因子诱变剂处理产生蛋白酶的菌株，根据试验菌诱变后在蛋白酶培养基上透明圈直径的大
11、小来指示诱变效应。一般来说，透明圈越大，蛋白酶活性越强。实验仪器与材料筛选出的蛋白酶的产生菌株、酪素培养基、无菌生理盐水、无菌水试管等；1mL无菌吸管、玻璃涂棒、血细胞计数板、显微镜、紫外线等、磁力搅拌器、台式离心机、震荡混合器等。实验方法与步骤1）菌悬液的制备：取培养48小时生长旺盛的出发菌株斜面4-5支，用10ml无菌生理盐水将菌苔洗下，倒入盛有玻璃珠的小三角烧瓶中，振荡30分钟，以打碎菌块。用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为每毫升10个。2）平板制作：将酪素培养基溶化后，冷至55左右时倒平板18套，凝固后待用。8课题名称：微生物学实验班机：食品药品监督管理111班实验日期：XX年4月
12、17日指导教师：吴小和试验一：普通光学显微镜的构造和使用1.掌握普通光学显微镜的基本构造、使用方法、保护要点。2.掌握普通光学显微镜油浸系的原理。3.使用油镜观察几种细菌的基本形态1、NAnsin式中NA=数值孔径；n=介质折射率；=最大入射角的半数，即镜口角的半数。2、式中=光波波长。显微镜、香柏油、乙醇-乙醚混合液、擦镜纸、吸水纸等。细菌三种形态的染色标本。1观察前的准备1、显微镜从显微镜柜或镜箱内拿出时，要用右手紧握镜臂，左手托住镜座，平稳地将显微镜搬运到实验桌上。将显微镜放在自己身体的左前方，离桌子边缘约10cm左右，右侧可放记录本或绘图纸。调节光照:不带光源的显微镜，可利用灯光或自然
13、光通过反光镜来调节光照，光线较强的天然光源宜用平面镜；光线较弱的天然光源或人工光源宜用凹面镜，但不能用直射阳光，直射阳光会影响物像的清晰并刺激眼睛。将10物镜转入光孔，将聚光器上的虹彩光圈打开到最大位置，用左眼观察目镜中视野的亮度，转动反光镜，使视野的光照达到最明亮最均匀为止。自带光源的显微镜，可通过调节电流旋钮来调节光照强弱。凡检查染色标本时，光线应强；检查未染色标本时，光线不宜太强。可通过扩大或缩小光圈、升降聚光器、旋转反光镜调节光线。2.低倍镜观察镜检任何标本都要养成必须先用低倍镜观察的习惯。因为低倍镜视野较大，易于发现目标和确定检查的位置。将标本片放置在载物台上，用标本夹夹住，移动推动
14、器，使被观察的标本处在物镜正下方，转动粗调节旋钮，使物镜调至接近标本处，用目镜观察并同时用粗调节旋钮慢慢下降载物台，直至物像出现，再用细调节旋钮使物像清晰为止。用推动器移动标本片，找到合适的目的像并将它移到视野中央进行观察。3高倍镜观察在低倍物镜观察的基础上转换高倍物镜。较好的显微镜，低倍、高倍镜头是同焦的，在转换物镜时要从侧面观察，避免镜头与玻片相撞。然后从目镜观察，调节光照，使亮度适中，缓慢调节粗调节旋钮，慢慢下降载物台直至物像出现，再用细调节旋钮调至物像清晰为止，找到需观察的部位，并移至视野中央进行观察,并准备用油镜观察。4油镜观察用粗调节器将镜筒提起约2cm，将油镜转至正下方。在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在香柏油中，其镜头几乎与标本相接，应特别注意不能压在标本上，更不可用力过猛，否则不仅压碎玻片，也会损坏镜头。从接目镜内观察，进一步调节光线，使光线明亮，再用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野出现物像为止，然后用细调节器校正焦距。如油镜已离开油面而仍未见物像，必须再从侧面观察，将油镜降下，重复操作至物像看清为止。5.观察完后复原下降载物台，将油镜头转出，先用擦镜纸擦去镜头上的油，再用擦镜纸蘸少许乙醚乙醇混合液擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦拭
