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1、为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划生物化学实验聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳,血清蛋白的分离的实验报告分子生物学实验报告实验名称：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳姓名：同组人：xxx学号：xxxx日期：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1引言SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是目前分离蛋白质亚基并测定其分子量的常用方法，为检测电泳后凝胶中的蛋白质，一般使用考马斯亮蓝染色1。本次实验的目的在于学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，并掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质的操作技术。2材料和方法实验原理聚丙烯酰胺凝胶的性能及制备原理性能聚丙烯酰胺凝胶的机械性
2、能好，有弹性，透明，相对地化学稳定，对pH和温度变化比较稳定，在很多溶剂中不溶，是非离子型的，没有吸附和电渗作用。通过改变浓度和交联度，可以控制孔径在广泛的范围内变动，并且制备凝胶的重复性好。由于纯度高和不溶性，因此还适于少量样品的制备，不致污染样品。制备原理聚丙烯酰胺凝胶是用丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化剂的作用下聚合而成。聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化系统有化学聚合和光聚合两种。本实验是用化学聚合。化学聚合的催化剂通常多采用过硫酸铵或过硫酸钾，此外还需要一种脂肪族叔胺作加速剂，最有效的加速剂是N,N,N,N-四甲基乙二胺。在叔胺的催化下，由过硫酸铵形成氧的自由基，后者又使单体形成自由基，从
3、而引发聚合反应。叔胺要处于自由碱基状态下才有效，所以在低pH时，常会延长聚合时间；分子氧阻止链的延长，妨碍聚合作用；一些金属也能抑制聚合；冷却可以使聚合速度变慢。通常控制这些因素使聚合在1小时内完成，以便使凝胶的性质稳定。聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳有两种系统，即只有分离胶的连续系统和有浓缩胶与分离胶的不连续系统，不连续系统中最典型、国内外均广泛使用的是著名的Ornstein-Davis高pH碱性不连续系统，其浓缩胶丙烯酰胺浓度为4，pH=，分离胶的丙烯酰胺浓度为，pH=。电极缓冲液的pH=，用Tris、SDS和甘氨酸配制。配胶的缓冲液用Tris、SDS和HCl配制。样品在电泳
4、过程中首先通过浓缩胶，在进入分离胶前由于等速电泳现象而被浓缩。这是由于在电泳缓冲液中主要存在三种阴离子，Cl、甘氨酸阴离子以及蛋白质SDS复合物，在浓缩胶的pH值下，甘氨酸只有少量的电离，所以其电泳迁移率最小，而Cl的电泳迁移率最大。在电场的作用下，Cl最初的迁移速度最快，这样在Cl后面形成低离子浓度区域，即低电导区，而低电导区会产生较高的电场强度，因此Cl后面的离子在较高的电场强度作用下会加速移动。达到稳定状态后，Cl和甘氨酸之间形成稳定移动的界面。而蛋白质SDS复合物由于相对量较少，聚集在甘氨酸和Cl的界面附近而被浓缩成很窄的区带，所以在浓缩胶中Cl是快离子，甘氨酸是慢离子。当甘氨酸到达分
5、离胶后，由于分离胶的pH值较大，甘氨酸离解度加大，电泳迁移速度变大超过蛋白质SDS复合物，甘氨酸和Cl的界面很快超过蛋白质SDS复合物。这时蛋白质SDS复合物在分离胶中以本身的电泳迁移速度进行电泳，向正极移动。由于蛋白质SDS复合物在单位长度上带有相等的电荷，所以它们以相等的迁移速度从浓缩胶进入分离胶，进入分离胶后，由于聚丙烯酰胺的分子筛作用，小分子的蛋白质可以容易的通过凝胶孔径，阻力小，迁移速度快；大分子蛋白质则受到较大的阻力而被滞后，这样蛋白质在电泳过程中就会根据其各自分子量的大小而被分离。溴酚蓝指示剂是一个较小的分子，可以自由通过凝胶孔径，所以它显示着电泳的前沿位置。当指示剂到达凝胶底部
6、时，停止电泳，从平板中取出凝胶。在适当的染色液中染色几个小时，而后过夜脱色。脱色液去除凝胶中未与蛋白结合的背底染料，这时就可以清晰地观察到凝胶中被染色的蛋白质区带。通常凝胶制备需要1小时，电泳在2530mA下通常需要3小时，染色23小时，过夜脱色。通常使用的垂直平板电泳可以同时进行多个样品的电泳2。凝胶浓度和交联度与孔径的关系凝胶浓度根据被分离的物质的分子量大小确定。当分析一个未知样品时，常先用%的标准凝胶或用410%的凝胶梯度来试测，而后选出适宜的凝胶浓度。凝胶的机械性能、弹性是否适中很重要，胶太软易断裂，；太硬则脆，也易折断。SDS-凝胶电泳法测定蛋白质分子量的原理蛋白质分子在聚丙烯酰胺凝
7、胶中电泳时，它的迁移率取决于所带净电荷及分子的大小和形状等因素。如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入SDS和巯基乙醇，则蛋白质分子的迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。在蛋白质溶液中加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原；SDS能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS复合物。SDS与蛋白质的结合带来两个后果：第一，使各种蛋白质的SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别，使所有的SDS-蛋白质复合物在电泳时都以同样的电荷蛋白质比向正极移动；第二，SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。这两个原
8、因使蛋白质-SDS复合物在凝胶电泳中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是蛋白质分子量的函数。选择一系列不同分子量的球形或基本呈球形的蛋白质作为标准物，使其形成SDS复合物。把这些复合物在相同条件下进行电泳分离，分子量小的物质泳动距离大，分子量大的物质泳动距离小。测定出相对泳动率，用相对泳动率对蛋白质的分子量的对数作图，它们在一定范围内呈直线关系。因此可作为标准曲线来检测样品蛋白质的分子量。染色原理常用的染料主要有氨基黑10B、考马斯亮蓝R250、考马斯亮蓝G250、1-苯胺基-8-萘磺酸，各有优缺点，本实验选用考马斯亮蓝R250，它的染色灵敏度比氨基黑高5倍，尤其适用于SDS电泳微
9、量蛋白质染色。实验材料试剂所用试剂有10%SDS、30%凝胶贮液、分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液、10%过硫酸铵、TEMED、电极缓冲液、上样缓冲液、蛋白质Maker、%考马斯亮兰R250染色液、甲醇：醋酸脱色液、异丙醇、tris-HCl缓冲液、二硫苏糖醇、去离子水等。器材所用器材有垂直板电泳槽、稳压稳流电泳仪、脱色摇床、50ml小烧杯、移液枪、枪头、玻璃棒、滤纸、表面皿、手套等。实验方法SDS聚丙烯酰胺的灌制按说明安装玻璃板，橡胶条放在两玻璃板之间，确定不漏液，玻璃板放入电泳槽时，有凹槽的一侧向里，时刻保持玻璃片间的压力。根据表1制备分离胶溶液，加入TEMED后迅速旋转混合物，用1ml移液枪将其
10、注入两块玻璃板之间的间隙中。用枪在聚丙烯酰胺溶液上小心的覆盖一层异丙醇。将凝胶垂直放于室温下。待聚合后，倒掉覆盖层，用去离子水清洗凝胶顶部，尽可能倒掉凝胶上的液体，用滤纸吸干水分。按表1配置浓缩胶，加完TEMED后迅速旋转混合，注满玻璃板间隙，插入梳子将胶垂直放置于室温下。约30min聚合完成，拔出梳子，用去离子水冲洗胶孔，再用滤纸吸干水。取出玻璃板，取下橡胶条。表1分离胶与浓缩胶配制电泳样品处理：将未加IPTG诱导的菌液37摄氏度摇至OD600=左右，离心部分菌液分装，分别加入适量不含DTT与含DTT的上样缓冲液，其余菌液加至浓度的IPTG20摄氏度进行诱导10h，分装菌液离心后分别加入适量
11、不含DTT与含DTT的上样缓冲液。电泳槽中加入300ml电泳缓冲液，所有样品均需煮沸10min,然后用20l加样枪依次加入IPTG诱导前的蛋白样品、诱导前加DTT的、诱导后样品和诱导后加DTT的、蛋白Maker，其余空加入等量的上样缓冲液。盖好盖子连接电源，慢慢调节电压至90V，进行电泳，待指示剂达到分离胶，把电压加到150V，至指示剂的红色条带移除胶体，停止电泳。染色、脱色将胶取出，并在右上角切个角，以标记顺序，放入培养皿中加入约40ml染色剂，放在摇床上染色1h，倒掉染色剂，先用清水洗几次，倒掉清水，再把胶放入脱色液中，脱色一天，每隔3h换一次脱色液,最后把胶取出来沥干水，拍照。3结果凝胶
12、经脱色后观察结果，拍照得到的电泳条带如图2所示。其中5、6、7、8条带为本组样品条带，所对应的样品分别为：IPTG诱导前的蛋白质样品、诱导前加DTT的蛋白质样品、诱导后的蛋白质样品和诱导后加DTT的蛋白质样品。最左端的电泳条带所对应的样品为蛋白质Maker，条带9所对应的样品为缓冲液。图1为蛋白质Marker的电泳条带图示。血清蛋白的分离聚丙烯酰胺凝胶电泳法【摘要】目的1.、学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。2、掌握聚丙烯酰胺园盘电泳的操作技术。3、比较醋酸纤维薄膜电泳与本法分离血清蛋白质的效果。方法采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对血清蛋白进行电泳分离，最后与醋酸纤维薄膜电泳的条带进行比较。结果聚丙稀酰胺
13、凝胶电泳法电泳鸡血清蛋白，在凝胶染色后出现了5条染色带。结论聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白的效果要比醋酸纤维薄膜电泳好得多。【关键词】聚丙烯酰胺凝胶电泳法、电泳、血清蛋白近年来我国家禽发生禽流感病状很严重，为了更好的预防和治疗禽流感，我们决定先采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法初步的鉴定鸡血清中含有几种蛋白质，因为大多数病毒都是依赖蛋白质为原料进行复制增多的。然后再用考马斯亮蓝R250对电泳出来的凝胶进行染色、鉴定。同时，也为了比较聚丙酰胺凝胶电泳法与醋酸纤维素薄膜电泳法分离血清蛋白的效果。对象与方法一、对象1、检测标本：选取一只健康的鸡，杀鸡取血置于一个大烧杯内，用分离法分离血清。2鸡血清的提取：采
14、用高速离心机对原血进行高速离心，上清液就是鸡血清。二、方法1、原理盘状电泳是在区带电泳原理的基础上，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，采用电泳基质的不连续体系，使样品在不连续的两相间积聚浓缩成很薄的起始区带，然后再进行电泳分离。1盘状电泳名称来源即由于此法的原理是依靠基质不连续性，凑巧分离出的区带也很象圆盘状，取“不连续性”及“圆盘状”的英文字头“disc”。因此，英文名称为discelectrophoresis，中文直译为盘状电泳。仪器装置：上下两个槽为圆形或方形，其中注入缓冲液。上下槽的缓冲液中分别有正、负电极通入。上槽底部有很多小孔，可插入装有聚丙烯酰胺凝胶的玻璃管。这里仅以Da
15、vis和Orstein用分析血清蛋白的高pH的不连续系统为便说明其基本原理。此系统是一个高pH的碱性系统，或称阴离子系统，最初用于分析血清蛋白，但也适用于其他的酸性和中性蛋白。很多细胞蛋白质，或病毒的结构蛋白在此系统中解离成阴离子，向阳极移动。系统由下列三种不连续的凝胶组成。即在每支玻璃管中装有三层不同的凝胶。最上层为样品胶，中层为浓缩胶，下层为分离胶。在盘状电泳过程中有三种物理效应：样品的浓缩效应，凝胶的分子筛效应，一般电泳分离的电荷效应。由于这三种物理效应,使样品分离效果好，分辨率高。例如人血清用纸电泳()可以分成57个成分，而用盘状电泳也可分成2030个条带清晰的成分。若采用不连续的浓度梯度凝胶柱，则可增至62个条带。又如人的唾液经盘状电泳。可分出10多个蛋白质条带。聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶为载体的一种区带电泳。该凝胶由丙烯酰胺和交联剂N，N甲叉双丙烯聚酰胺聚合而成。聚丙烯酰胺凝胶电泳利用电泳和分子筛的双重作用分离物质。Acr和Bis单独存在或混合在一起时是稳定的，但在具有自由基团体系时就能聚合。引发自由基团的方法有化学法和光化学法两种。化学法的引发剂是过硫酸胺，催化剂是四甲
