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1、为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划微生物大小的测定报告山东大学生命科学学院09级生科四班张行润XX摘要通过显微测微尺测量酿酒酵母和枯草芽孢杆菌的直径或长和宽，对其细胞体的大小有一个具体的了解；使用血细胞计数板对稀释n倍的酵母菌悬液进行细胞数量的测定，从而达到定量了解微生物的生长繁殖情况。关键词目镜测微尺物镜测微尺血球计数板前言微生物细胞的大小，是微生物重要的形态特征之一，也是分类鉴定的依据之一，也让我们对微生物的实际大小有了一个感性的认识。(来自:写论文网:微生物大小的测定报告)微生物数量的测定在微生物生长曲线中运用
2、非常重要，我们从微生物的数量上了解其生长状况，这也能指导我们的生产工业。一、实验目的1.了解显微镜测定微生物大小与血球计数板测定微生物数量的原理。2.学习并掌握显微镜下测定微生物细胞大小的技术，包括目镜测微尺、镜台测微尺的校正技术与测定细胞大小的技术。3.了解血球计数板的结构，学习并掌握血球计数板计数微生物数量的技术，包括样品的点样、菌数计数的方法与计算。二、实验原理1.微生物大小测定原理微生物细胞的大小，是微生物重要的形态特征之一，也是分类鉴定的依据之一。由于菌体很小、只能在显微镜下来测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。1）目镜测微尺目镜测微尺是一块圆形玻片，在玻片中
3、央把5mm长度刻成50等分，或把10mm长度刻成100等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上(此处正好与物镜放大的中间像重叠)来测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。图1目镜测微尺图2镜台测微尺镜台测微尺镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般将lmm等分为100格，每格长l0m，是专门用来校正目镜测微尺的。校正时，将镜台测微尺放在载物台上，由于镜台测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经过物镜和目
4、镜的两次放大成象进入视野，即镜台测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大，因此从镜台测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小，所以用镜台测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度，然后移去镜台测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。2.血球计数板测定微生物数量的原理镜检计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌泡子可采用血球计数板；一般细菌则采用彼得罗夫霍泽(PetroffHausser)细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数
5、板较厚，不能使用油镜，故细菌不易看清。血球计数板是一块特制的厚载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个方格网(图3)。每个方格网共分9大格，其中间的一大格(又称为计数室)常被用作微生物的计数。计数室的刻度有两种：一种是大方格分为16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。但是不管计数室是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即每个大方格都由400个小方格组成(图4)。每个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，每个小方格的面积为21400mm，盖上盖玻片
6、后，盖玻片与计数室底部之间的高度为，所以每个(大方格)的体积为，每个小方格的体积为l4000mm3。使用血球计数板直接计数时，先要测定每个小方格(或中方格)中微生物的数量，再换算成每毫升菌液(或每克样品)中微生物细胞的数量。图3血球计数扳的构造a.平面图(中间平台分为两半，各半边有一个方格网)b.侧面图(中间平台与盖玻片之间有高度为毫米的间隙)图4血球计数板计数网的分区和分格三、实验材料1.仪器显微镜，目镜测微尺，镜台测微尺，血球计数板、盖玻片、吸水纸、计数器、滴管、擦镜纸，酒精灯2.材料酵母菌液，枯草芽孢杆菌斜面培养物3试剂美兰染液，结晶紫，蒸馏水等实验方法1目镜测微尺的校正把目镜的上透镜旋
7、下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把镜台测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器，使两尺重叠，再使两尺的“0”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。因为镜台测微尺的刻度每格长l0m，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度。目镜测微尺每格长度=两重合线间镜台测微尺的格数10两重合线间目镜测微尺的格数用此法分别校正在物镜倍数为10，40，100下目镜测微尺每小格所代表的长度。注意事项由于不同显微镜及附
8、件的放大倍数不同，因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件进行，而且只能在特定的情况下重复使用，当更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度。2细胞大小的测定A.酵母菌的大小测定1)取一滴酵母菌菌悬液制成水浸片。2)移去镜台测微尺，换上酵母菌水浸片，先在低倍镜下找到目的物，然后在高倍镜下用目镜测微尺来测量酵母菌菌体的长，宽各占几格。测出的格数乘上目镜测微尺每格的校正值，即等于该菌的长和宽。B.枯草芽孢杆菌的大小测定1)将载玻片洗净晾干后，在其中央滴一滴蒸馏水，然后通过无菌操作用接种针取少量枯草芽孢杆菌的斜面培养物于蒸馏水中，然后干燥2)单染色用结晶紫染液或美兰
9、染液对其进行单染色，染色一定时间后冲洗载玻片的背面，将染液冲洗掉3)置于显微镜下镜检，用目镜测微尺测量枯草芽孢杆菌的长和宽注意事项43个大小相近的菌体，求出平均值，才能代表该菌的大小。而且一般是用对数生长期的菌体进行测定。3.酵母菌菌悬液中酵母菌菌数的测定(1)取洁净的血球计数板一块，在计数室上盖上一块盖玻片。(2)将酵母菌菌悬液充分摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的右上角滴入一小滴(不宜过多)，使菌液沿两玻片间自行渗入计数室，勿使产生气泡，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌液。(3)先在低倍镜下找到计数室后，再转换高倍镜观察计数。(4)计数时用16中格的计数板，要按对
10、角线方位，取左上、左下、右上、右下的4个中格(即100小格)的酵母菌数。如果是25中格计数板。除数上述四格外，还需数中央1中格的酵母菌数(即80小格)。由于菌体在计数室中处于不同的空间位置，要在不同的焦距下才能看到，因而观察时必须不断调节微调螺旋，方能数到全部菌体，防止遗漏。如菌体位于中格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。(5)凡酵母菌的芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复分数2-3次(每次数值不应招差过大，否则应重新操作)，取其平均值，按下述公式计算出每毫升菌液所含酵母菌细胞数。(6)血球计数板用后，在水龙头上用水柱冲洗干净，可以用去污粉洗
11、净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或吹风机吹干。五、实验结果5微生物大小及数量的测定一、实验目的：1、学习并掌握使用显微镜测微尺测定微生物大小的方法2、掌握对不同形态细菌细胞大小测定的分类学基本要求，增强对微生物细胞大小的感性认识3、学习并掌握使用血细胞计数板测定微生物细胞或孢子数量的方法二、实验器材1、菌种：枯草芽孢杆菌、酿酒酵母2、溶液和试剂香柏油、二甲苯、美兰染液3、仪器和其他用品目镜测微尺、镜台测微尺、普通光学显微镜、擦镜纸、软布、血细胞计数板、凹载玻片、盖玻片、接种环、酒精灯、试管、吸管、移液枪三、实验原理1、测微尺：微生物大小的测定，需要借助于特殊的测量工具
12、显微测微尺，它包括目镜测微尺和镜台测微尺两个互相配合使用的部件。镜台测微尺是一个在特制载玻片中央封固的标准刻尺，其尺度总长为1mm，精确分为10个大格，每个大格又分为是10个小格，共100个小格，每个小格长度为，即10m。刻线外有一直径为3，粗线为的圆，以便调焦时寻找线条。刻线上还覆盖有厚度为的盖玻片，可保护刻线久用而不受损伤。镜台测微尺并不直接用来测量细胞的大小，而是用于校正目镜测微尺每一格的相对长度。目镜测微尺是一块可放入接目镜内的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻度，一般有等分为50个小格和100个小格两种。测量时，需将其放在接目镜中的隔板上，用以测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同显微
13、镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不一样，目镜测微尺每小格在不同条件下所代表的实际长度也不一样。因此，用目镜测微尺测量微生物大小时，必须先用镜台测微尺进行校正，以求出该显微镜在一定放大倍数的目镜和物镜下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。然后根据微生物细胞相当于目镜测微尺的格数，即可计算出细胞的实际大小。球菌用直径表示大小，杆菌用长和宽来表示大小2、显微镜计数：显微镜计数是将少量待测样品的悬浮液置于一种特定的具有确定容积的载玻片上，于显微镜下直接观察、计数的方法。目前国内外常用的计菌器有：血细胞计数板、Peteroff-Hauser计菌器以及Hawksley计菌器等，它们可用于各种微生物单细胞悬
14、液的计数，基本原理相同。其中血细胞计数板较厚，不能用油镜，常用于个体相对较大的酵母细胞、霉菌孢子等的计数，而后两种计数器浇薄，可拥油镜对细菌等较小的细胞进行观察和计数。除了使用上述这些计菌器外，还有用已知颗粒浓度的样品如血液与未知浓度的微生物细胞样品混合后根据比例推算后者浓度的比例计数法。显微镜计数法的优点是直观、快速、操作简单，缺点则是所测得的结果通常是死菌体和活菌体的总和，且难以对运动性强的活菌进行计数。目前已有一些方法可以克服这些缺点，如结合活菌染色、微室培养以及加细胞分裂抑制剂等方法来达到只计数活菌体的目的，或用染色处理等杀死细胞以计数运动性细菌等。本实验以常用的血细胞计数板为例对显微
15、计数法的具体操作的具体操作进行介绍。血细胞计数板是一块特制的载玻片，其上由4条槽构成3个平台。中央较宽的平台又被一短槽横隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分成9个大方格，中间的大方格即为计数室。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分为25个中方格，而每个中方格又分为16个小方格；另一种是一个大方格分为16个中方格，而每个中方格又分为25个小方格，但无论哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是400个。每一个大方格边长为1mm，则每一个大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为，所以计数室的容积为。计数时，通常数5个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘以25或16，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成1ml菌液中的总菌数。以25个中方格的计数板为例，设5个中方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数为B，则：1ml菌液
