为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划基于纳米材料的肿瘤活体荧光成像以及光动力学治疗研究 活体动物体内生物发光和荧光成像技术 基础原理与应用简介 文章来自中国生物器材网 文章目录： 一、活体生物发光成像技术 二、活体动物荧光成像技术 三、生物发光成像与荧光成像的比较 四、活体动物可见光成像仪器原理与操作流程 活体动物体内成像技术是指应用影像学方法，对活体状态下的生物过程进行组织、细胞和分子水平的定性和定量研究的技术活体动物体内成像技术主要分为可见光成像(opticalimaging)、核素成像、核磁共振成像和超声成像、计算机断层摄影或Cyt及dyes等荧光染料进行标记，利用荧光蛋白或染料产生的荧光就可以形成体内的荧光光源前者是动物体内的自发光，不需要激发光源，可通过高度灵敏的CCD直接捕捉光信号，而后者则需要外界激发光源的激发才可以捕捉发光信号传统的动物实验方法需要在不同的时间点宰杀实验动物以获得数据,得到多个时间点的实验结果相比之下，体内可见光成像技术通过对同一组实验对象在不同时间点进行记录，跟踪同一观察目标的移动及变化，所得的数据也更加真实可信。
另外,这一技术由于不涉及放射性物质，具有操作简单，所得结果直观，灵敏度高等特点,在刚刚发展起来的几年时间内，已广泛应用于生命科学、医学研究及药物开发等方面 一、活体生物发光成像技术 技术原理 1.标记原理 哺乳动物生物发光，一般是将Fireflyluciferase基因即荧光素酶基因整合到预期观察的细胞染色体DNA上以表达荧光素酶，培养出能稳定表达荧光素酶的细胞株，当细胞分裂、转移、分化时,荧光素酶也会得到持续稳定的表达基因、细胞和活体动物都可被荧光素酶基因标记将标记好的细胞接种到实验动物体内后，当外源给予其底物荧光素(luciferin)，即可在几分钟内产生发光现象这种酶在ATP，氧存在的条件下，催化荧光素的氧化反应才可以发光，因此只有在活细胞内才会产生发光现象，并且发光光强度与标记细胞的数目线性相关 除FireflyLuciferase外，有时也会用到RenillaLuciferase二者的底物不一样，前者的底物是荧光素，后者的底物是coelentarizine二者的发光波长不一样，前者所发的光波长在540~600nm，后者所发的光波长在460~540nm左右前者所发的光更容易透过组织，后者在体内的代谢比前者快，而且特异性没有前者好，所以大部分活体实验使用FireflyLuciferase作为报告基因，如果需要双标记，也可采用后者作为备选方案。
荧光素酶的发光是生物发光，不需要激发光，但需要底物荧光素荧光素在氧气、ATP存在的条件下和荧光素酶发生反应，生成氧化荧光素(oxyluciferin)，并产生发光现象 对于细菌标记，一般利用发光酶基因操纵子luxABCDE或luxCDABE，其由控制的编码荧光素酶的基因和编码荧光素酶底物合成酶的基因组成利用这种办法进行标记的细菌会持续发光，不需要外源性底物但是一般细菌标记需要转座子的帮助把外源基因插入到细菌染色体内稳定表达 2.底物荧光素的特点 荧光素由于诸多优点得到广大科研人员的青睐，主要特点如下： (1)荧光素不会影响动物的正常生理功能 (2)荧光素是280道尔顿的小分子，水溶性和脂溶性都非常好，很容易穿透细胞膜和血脑屏障 (3)荧光素在体内扩散速度快，可通过腹腔注射或尾部静脉注射进入动物体内腹腔注射扩散较慢，持续发光长荧光素腹腔注射老鼠后约1min后表达荧光素酶的细胞开始发光，10min后强度达到稳定的最高点，在最高点持续约20~30min后开始衰减，约3h后荧光素排除，发光全部消失，最佳检测时间是在注射后15~35min之间；若进行荧光素静脉注射，扩散快，但发光持续时间很短。
科研人员根据大量的实验总结出荧光素的合适的用量是150mg/kg，即体重20克的小鼠需要3毫克的荧光素 (4)观察时间的间隔没有最短限制，只要观察的条件控制一致就可以虽然底物在动物体内有一定的代谢过程，但是上一次底物的残留曲线可以知道，可以控制对下一次观察结果的影响 3.光学原理 光在哺乳动物组织内传播时会被散射和吸收，光子遇到细胞膜和细胞质时会发生折射现象，而且不同类型的细胞和组织吸收光子的特性并不一样血红蛋白是造成体内可见光被吸收的主要因素，其吸收可见光中蓝绿光波段的大部分但是在可见光大于600纳米的红光波段，血红蛋白的吸收作用却很小因此，在偏红光区域,大量的光可以穿过组织和皮肤而被检测到利用活体动物生物发光成像技术最少可以检测到皮下的几百个细胞当然，由于发光源在老鼠体内深度的不同可看到的最少细胞数是不同的一般认为，每一厘米深度，发光强度衰减10倍，血液丰富的组织或器官衰减多，与骨骼相邻的组织或器官衰减少在相同的深度情况下，检测到的发光强度和细胞的数量具有非常好的线性关系，可由仪器量化检测到的光强度，反映出细胞的数量 活体生物发光成像技术应用领域 活体生物发光成像技术是一项在某些领域有不可替代优势的技术，比如肿瘤转移研究、药物开发、基因治疗、干细胞示踪等方面。
1．肿瘤学 活体生物发光成像技术能够让研究人员能够直接快速的测量各种癌症模型中肿瘤的生长、转移以及对药物的反应其特点是极高的灵敏度使微小的肿瘤病灶也可以被检测到，比传统方法的灵敏度大大提高了；非常适合于肿瘤体内生长的定量分析；避免由于宰杀老鼠而造成的组间差异；节省动物成本由于以上特点，使基于转移模型、原位模型、自发肿瘤模型等方面的肿瘤学研究得到发展建立肿瘤转移模型，可以观察肿瘤转移情况，进一步探讨肿瘤转移的机制；可进行原位接种，观察原位以及原位转移模型，使肿瘤学研究更接近肿瘤临床发病的微观环境；通过建立自发肿瘤模型，可以观察肿瘤发生机理 图11-1肿瘤的长期检测，左图分别是7天，14天，30天成像来自中国军事医学科学院 2．药物研究 在药效学评价方面，荧光素酶癌症模型可用于癌症体内用药在整体动物水平上进行长期疗效跟踪观察利用无创伤活体成像对癌细胞生长的检测，可对癌症治疗之前和过程中的癌细胞的变化进行实时观测和评估这种方式提供一个很好的对癌细胞的反应和复发评估的预诊断途径用活体成像的方法比传统技术有更高的灵敏度，当用传统的方法还不能检测到瘤块时，用该技术已经可以检测到很强的信号。
由于该技术只是检测活细胞，不能检测已经凋亡的细胞而用传统的方法，不能区别正常细胞与凋亡的细胞，所以该技术可以比传统技术更早更灵敏的发现药物的疗效 利用活体成像技术高灵敏度、观察方便的特点，在抗肿瘤药物临床前研究中，通过给予肿瘤接种的小鼠不同剂量，不同给药时间、不同给药途径，观察抗肿瘤药物的最佳给药途径、给药剂量及给药时间，从而制定合适的剂型与服药时间 在药物代谢方面，标记与药物代谢有关的基因，比如CYP3A4等，研究不同的药物对该基因表达的影响，从而可以间接知道相关药物在体内代谢的情况 在药剂学研究方面，可以通过把荧光素酶报告基因的质粒直接装载在药物载体中，观察药物载体的靶向脏器与体内分布规律在药理学方面，还可以通过转基因小鼠的应用，观察药物作用的通路，用荧光素酶基因标记某一个兴趣基因，观察药物作用的通路 图11-2利用IL-1Β转基因小鼠筛选抗炎症药物，来自上海南方模式生物研究中心 3．基因治疗 基因治疗是将正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的目前，基因治疗主要是以病毒做载体，可应用荧光素酶基因作为报告基因加入载体，观察目的基因是否到达动物体内的特异组织和是否持续高效表达，这种非侵入方式具有低毒性及免疫反应轻微等优点且可以直接实时观察，了解病毒或载体侵染的部位和时域信息；荧光素酶基因也可以插入脂质体包裹的DNA分子中，用来观察脂质体为载体的DNA运输和基因治疗情况；也可以表达荧光素酶基因的质粒裸DNA为模型DNA，直接注入动物体内，利用生物发光成像可以分析不同载体、不同注射位点、不同注射量对荧光素酶基因表达的影响，同时也可以时空量化分析基因表达的分布、水平和持续时间。
这种可视的方法直观地评价DNA的转染效率和表达效率，在基因治疗研究中具有重要的指导作用 4．干细胞及免疫学 用荧光素酶标记干细胞有以下几种方法：一种是标记组成性表达的基因，做成转基因动物，干细胞就被标记了，若干细胞移植到另外动物体内，可以用活体生物发光成像技术示踪干细胞在体内的增殖、分化及迁徙的过程；另外一种方法是用慢病毒直接标记干细胞后，移植到体内观测其增殖、分化及迁徙过程，研究其修复、治疗损伤或缺陷部分的效果，进一步探讨其机制 可以通过标记免疫细胞，观察免疫细胞对肿瘤细胞等的识别和杀死功能，评价免疫细胞的免疫特异性、增殖、迁移及功能等；通过标记异体细胞，观察异体细胞对器官移植影响；也可进行一些关于免疫因子的研究等 5．基因表达模式与基因功能研究 研究基因表达可以从影响基因表达的各个不同的层面进行相关的研究，如利用融合蛋白，兴趣基因启动子控制的荧光素酶，siRNA方式和转基因动物等方法 为研究目的基因是在何时、何种刺激下表达，将荧光素酶基因插入目的基因启动子的下游，并稳定整合于实验动物染色体中，形成转基因动物模型通过这种方法实现荧光素酶和目的基因的平行表达，从而可以直接观察目的基因的表达模式，包括数量、时间、部位及影响其表达和功能的因素等；也可用于研究动物发育过程中特定基因的时空表达情况，观察药物诱导特定基因表达；以及其它生物学事件引起的相应基因表达或关闭。
6．蛋白质相互作用 可利用动物体内生物发光成像技术研究活体动物体内蛋白与蛋白的相互作用其原理是将分开时都不单独发光的荧光酶的C端和N端分别连接在两个不同的蛋白质上，若是这两个蛋白质之间有相互作用，荧光酶的C端和N端就会被连接到一起，激活荧光素酶的转录表达，在有底物存在时出现生物发光在活体条件下研究药物对蛋白质相互作用的影响，可以观察到在体外实验中无法模拟的活体环境对蛋白质相互作用的影响 7．细胞凋亡 利用活体动物生物发光成像技术，直接观察活体动物体内的细胞凋亡具体原理是用分子生物学方法在荧光酶的两端连接上抑制其发光的蛋白(如雌激素)，但在其连接处加上caspase(细胞凋亡时特异表达的一种酶)的酶切点细胞发生凋亡时，表达caspase，切开抑制荧光酶发光的蛋白，使荧光素酶开始发光 8.疾病机理 可以标记与某种疾病密切相关的基因，做成转基因小鼠，通过特定的药物作用或其他条件下该基因表达的变化，来推测该疾病的发病机理和药物对疾病治疗的效果等 9．其他 如RNAi、蛋白质核运输等在荧光素酶基因的一端接要研究的蛋白质的基因，另一端接肯定在细胞核内表达的蛋白的基因，当核外的蛋白运输到核内时，就会导致荧光素酶N端、C端靠近，恢复发光。
二、活体动物荧光成像技术 技术原理 1．标记原理 活体荧光成像技术主要有三种标记方法 荧光蛋白标记：荧光蛋白适用于标记细胞、病毒、基因等，通常使用的是GFP、EGFP、RFP等； 荧光染料标记：荧光染料标记和体外标记方法相同，常用的有Cy3、Cy5、及Cy7，可以标记抗体、多肽、小分子药物等； 量子点标记：量子点活体动物荧光成像技术应用领域 1．肿瘤学 活体荧光成像技术能够无创伤定量检测小鼠的皮下瘤模型相对于生物发光成像技术，活体荧光成像技术检测时间较快，只需要不到1s的时间，同时不需要注射底物，节约了检测成本但是需要选择近红外荧光检测深部组。